地衣芽孢桿菌發酵條件優化和抑菌活性測定

張 鈺，馬 曦，趙金標，魯 琳

(1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193)

抗生素能通過其分子結構識別靶細菌膜表面的結合位點[1]，抑制細菌生長甚至滅殺細菌。畜牧業中使用抗生素雖能提高畜禽的生長性能，但同時也帶來許多危害[2-3]。目前，全球畜牧業禁抗已成為趨勢，歐盟畜牧業在20世紀末陸續禁用維吉尼亞霉素、螺旋霉素等多種抗生素[4]。但各國畜牧業禁抗后陸續出現畜禽生產性能下降，疾病發生率上升等問題[5-6]。中國農業農村部第194號公告規定自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，自2020年7月1日起，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。尋找合適的替抗產品對中國畜牧業今后的發展極為重要。

地衣芽孢桿菌作為替代抗生素的飼用益生菌，能分泌纖維素酶、幾丁質酶等多種外源酶[7]，可幫助畜禽消化飼料[8]，改善腸道組織結構[9-10]。地衣芽孢桿菌具有廣泛的抑菌譜，能抑制致病菌黏附在腸黏膜表面，并通過分泌多種脂肽類抑菌物質來抑制致病菌的生長[11-13]，且對部分真菌及霉菌具有良好的抑制作用[14]。此外，有研究顯示，親緣個體間的腸道菌群存在相似性[15]，地衣芽孢桿菌改變畜禽親代腸道菌群可能對子代腸道微生物區系造成影響。目前，地衣芽孢桿菌已被歐美多國批準用于畜牧業生產[16-17]。

地衣芽孢桿菌在畜牧業中應用還需探究發酵過程中的各項參數，且不同地衣芽孢桿菌菌株可能攜帶有不同抗生素抗性基因[18]，需探究其生物安全問題。本研究基于前期篩選得到的1株地衣芽孢桿菌19148，測定其在體外發酵的抑菌活性及適宜的發酵條件，分析其對多種抗菌藥的耐藥性，以期為下一步利用地衣芽孢桿菌生產畜禽發酵飼料，探究其發揮益生功能的機理機制提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

地衣芽孢桿菌19148(Bacilluslicheniformis19148)由中國農業大學農業農村部飼料工業中心分離和保存[19]；供試致病菌大腸桿菌(EscherichiacoliK88)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus1882)均由中國農業大學農業農村部飼料工業中心動物營養國家重點實驗室保存。

1.2 培養基

LB培養基、MHA培養基(北京奧博星生物技術有限公司)；藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)。

1.3 地衣芽孢桿菌19148抑菌條件分析

1.3.1 不同pH對地衣芽孢桿菌19148抑菌效果的影響 設置pH 2.0～12.0共11個處理，每個處理3個重復。用1 mmol/L的NaOH和0.5 mmol/L的HCl調整LB液體培養基pH。制備好的培養基用高壓滅菌鍋滅菌，冷卻后用無菌接種環挑取地衣芽孢桿菌19148單菌落接種到100 mL液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養24 h。將培養得到的菌液7 500 r/min離心15 min，取上清液，用0.2 μm濾膜過濾制成無菌濾液。另用無菌生理鹽水分別將大腸桿菌K88、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌1882菌液稀釋至D600 nm值為0.05，按照1∶50的比例與LB固體培養基混合后，取20 mL倒入培養皿，牛津杯打孔后向孔中加入200 μL無菌濾液，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑。

1.3.2 不同溫度對地衣芽孢桿菌19148抑菌效果的影響 設置4、25、37、45和75 ℃共5個處理，每個處理3個重復。將接種后的培養基置于相對應的溫度條件下，200 r/min培養24 h。取菌液制備成無菌濾液，以牛津杯抑菌試驗檢測其抑菌活性。

1.3.3 不同濃度金屬離子對地衣芽孢桿菌19148抑菌效果的影響 設置0、1、2、4 mmol/L的銅離子組和鎂離子組共8個處理，每個處理3個重復。用硫酸銅和硫酸鎂調整LB液體培養基中銅離子和鎂離子的濃度，無菌接種環挑取單菌落進行接種，37 ℃、200 r/min培養24 h。取菌液制備成無菌濾液，以牛津杯抑菌試驗檢測其抑菌活性。

1.4 地衣芽孢桿菌19148體外發酵最適條件探究

用接種環挑取LB固體培養基表面的地衣芽孢桿菌19148單菌落，接種到盛有50 mL LB液體培養基的三角瓶中(100 mL規格)，放入搖床37 ℃、200 r/min培養24 h后作為種子液，后續試驗用種子液進行液體接種，并以無菌發酵液的抑菌圈直徑為指標，探究地衣芽孢桿菌19148的最適發酵條件。

1.4.1 不同種子液接種量對地衣芽孢桿菌19148體外發酵的影響 設置1%、3%、5%和7%接種量共4個處理，每個處理3個重復。向滅菌后的LB液體培養基中按照種子液體積百分比進行接種，37 ℃、200 r/min發酵24 h，發酵液經離心過濾后制成無菌發酵濾液，以牛津杯抑菌試驗檢測其抑菌活性。

1.4.2 不同發酵時間對地衣芽孢桿菌19148體外發酵的影響 設置16、20、24、28和32 h共5個處理，每個處理3個重復。將種子液按照1%體積百分比接至LB液體培養基，37 ℃、200 r/min發酵，并在相應的時間點取樣，制備成無菌發酵濾液，以牛津杯試驗檢測其抑菌活性。

1.4.3 不同搖床轉速對地衣芽孢桿菌19148體外發酵的影響 設置100、150、200、250和300 r/min共5個處理，每個處理3個重復。LB液體培養基中接種1%種子液，37 ℃發酵24 h后以牛津杯試驗檢測無菌發酵濾液的抑菌活性。

1.5 地衣芽孢桿菌19148耐藥性評價

以麥氏比濁管作為參考標準，用無菌生理鹽水將地衣芽孢桿菌19148菌液稀釋至0.5麥氏濁度單位(MCF)，菌液濃度約為1.5×108CFU/mL，并用LB培養基作為比對，排除培養基本身顏色對的菌液濁度的干擾。用無菌棉拭子蘸取少量稀釋后的菌液涂布于MHA培養基表面，待干燥后將含有不同抗菌藥的濾紙片貼附在MHA培養基表面，37 ℃培養24 h，測量并記錄抑菌圈直徑。無抑菌圈或抑菌圈直徑<10 mm為耐藥，抑菌圈直徑在10～15 mm之間為中介，抑菌圈直徑>15 mm為敏感。

1.6 數據統計分析

采用Excel 2010和SPSS 23.0軟件對試驗數據進行統計分析，對不同處理組間的差異進行單因素方差分析，應用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結 果

2.1 地衣芽孢桿菌19148抑菌條件分析

2.1.1 不同pH對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響 pH為2.0、3.0、4.0、10.0、11.0、12.0處理組地衣芽孢桿菌19148生長受到抑制，菌液較為澄清。pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0處理組地衣芽孢桿菌19148有明顯的生長跡象，其無菌濾液對金黃色葡萄球菌1882沒有抑制效果，對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌有明顯的抑制作用，其中pH 5.0、6.0和7.0處理組的抑菌效果顯著高于pH 8.0和9.0處理組(P<0.05)，且3組間無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

大腸桿菌K88組間，不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；鼠傷寒沙門氏菌組間，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.1.2 不同溫度對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響 4和75 ℃處理組地衣芽孢桿菌19148生長明顯受到抑制，菌液較為澄清；25、37和45 ℃處理組正常生長。37 ℃處理組無菌濾液對沙門氏菌和大腸桿菌K88有抑菌活性(P<0.05)，不抑制金黃色葡萄球菌1882；4、25、45和75 ℃處理組無菌濾液對3種致病菌均無抑菌活性(圖2)。

圖2 不同溫度對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響

2.1.3 不同濃度金屬離子對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響 不同濃度硫酸銅處理組無菌濾液對大腸桿菌K88、沙門氏菌和金黃葡萄球菌1882均沒有抑制作用。1、2和4 mmol/L鎂離子處理組無菌濾液對大腸桿菌K88的抑菌活性沒有顯著性差異(P>0.05)，且3組均顯著高于0 mmol/L鎂離子處理組(P<0.05)。0、1和2 mmol/L鎂離子處理組對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性沒有顯著性差異(P>0.05)，且3組均顯著高于4 mmol/L鎂離子處理組(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同濃度鎂離子對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響

2.2 地衣芽孢桿菌19148體外發酵最適條件探究

2.2.1 不同種子液接種量對地衣芽孢桿菌19148體外發酵的影響 3%和5%接種量處理組無菌濾液對大腸桿菌K88的抑菌活性顯著高于1%組和7%組(P<0.05)，且3%和5%組之間無顯著差異(P>0.05)，1%、3%和5%接種量處理組無菌濾液對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性顯著性高于7%組(P<0.05)，且3組間沒有顯著性差異(圖4)。

圖4 不同種子液接種量對發酵液抑菌作用的影響

2.2.2 不同發酵時間對地衣芽孢桿菌19148體外發酵的影響 28 h處理組無菌濾液對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果顯著高于20、24和32 h處理組(P>0.05)(圖5)。

圖5 不同發酵時間對發酵液抑菌作用的影響

2.2.3 不同搖床轉速對地衣芽孢桿菌19148體外發酵的影響 150和200 r/min處理組無菌濾液的抑菌效果顯著高于100、250和300 r/min處理組(P<0.05)，且兩組之間無顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 不同搖床轉速對發酵液抑菌作用的影響

2.3 耐藥性評價

地衣芽孢桿菌19148對27種抗菌藥耐藥性檢測結果顯示，地衣芽孢桿菌19148對青霉素、四環素、頭孢他啶、呋喃唑酮和多黏菌素B 5種抗菌藥表現出中介，對諾氟沙星、氨芐西林、氯霉素等其他22種抗菌藥表現出敏感(表1)。

表1 地衣芽孢桿菌19148 對27種抗菌藥的耐藥性

3 討 論

3.1 地衣芽孢桿菌19148抑菌條件分析

飼用益生菌應用于發酵飼料的生產，首先要具備較強的抗逆性。飼用益生菌需要在高溫加工、低溫冷藏等飼料加工工藝過程中保持益生功能。王芬等[20]利用枯草芽孢桿菌發酵花生粕，發現在36 ℃枯草芽孢桿菌的生物活性最高，且隨溫度升高或降低，其活性逐漸下降。苗永美等[21]通過單因素試驗探究pH對枯草芽孢桿菌抑菌活性的影響，結果顯示，當初始pH為5.0時，菌株發酵物的抑菌率最高。王曉潔等[22]探究鎂離子濃度對側孢短芽孢桿菌分泌抗菌脂肽的影響發現，在13.01 g/L鎂離子發酵液中抗菌脂肽含量最多。本試驗中，地衣芽孢桿菌19148表現出了對外界培養條件良好的耐受性，且菌株抑菌活性的最適培養條件與前人研究一致。

3.2 地衣芽孢桿菌19148體外發酵最適條件探究

飼用益生菌在不同的發酵條件下會產生不同的發酵產物，為降低益生菌發酵飼料的生產成本，需對其發酵培養條件進行優化，從而提高發酵效果和益生能力。李光月等[23]利用響應面試驗對枯草芽孢桿菌的發酵工藝進行優化，結果顯示，枯草芽孢桿菌在200 r/min的轉速下，表面活性素的產量最大。秦楠等[24]探究了1株解淀粉枯草芽孢桿菌的發酵特性，結果表明在接種量3%、發酵13 h時，其無菌發酵濾液的抑菌活性最好。但也有研究指出，枯草芽孢桿菌的最適接種量為1.46%[25]。導致這種差異的主要原因可能是發酵液營養水平及不同芽孢桿菌菌株生長速率的不同。本試驗結果顯示，在3%接種量、150 r/min發酵28 h時，地衣芽孢桿菌19148抑菌活性最好。

3.3 地衣芽孢桿菌19148耐藥性評價

長久以來，細菌間獲取和發展一系列抗生素耐藥機制一直是益生菌應用于畜禽飼料生產的重要阻礙。益生菌產品想要真正替代畜牧業中促生長類抗生素的使用，不僅自身不能對抗生素表現出耐藥性，且不能使腸道病原菌對益生菌發揮抑菌活性的途徑產生新的耐藥機制。由于地衣芽孢桿菌屬細菌的遺傳相似度很高，很難用遺傳標記物進行鑒定和分類，而這就需要在菌株水平對地衣芽孢桿菌的耐藥性進行檢測。本研究采用27種不同種類的抗菌藥對地衣芽孢桿菌19148的耐藥性進行檢測，結果顯示除了對多黏菌素B、呋喃唑酮、頭孢他啶、四環素和青霉素表現為中介外，其余22種抗菌藥均為敏感，因此地衣芽孢桿菌19148不具有抗菌藥耐藥性問題。

4 結 論

地衣芽孢桿菌191418對外界環境具有良好的穩定性，在pH 6.0、溫度37 ℃、鎂離子濃度為1 mmol/L的培養條件下，其抑菌活性最強。體外發酵過程中，3%種子液接種量、150 r/min發酵28 h是其抑菌活性最適發酵條件。藥敏試驗結果顯示地衣芽孢桿菌對27種不同類型的抗菌藥表現為中介或敏感性，不具有耐藥性。