豬鏈球菌臨床分離株對四環素類抗生素的耐藥性和耐藥基因分析

劉寶玲，楚品品，李春玲，楊冬霞，蔣智勇，張昆麗，宋 帥,勾紅潮，蔡汝健

(1.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640；2.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣州 510225)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種革蘭氏陽性細菌，能引起多種疾病，嚴重時能引起人和豬的死亡，屬于危害較大的傳染性人獸共患病原[1]。隨著規模化養殖的發展及抗生素的不規范使用，豬鏈球菌的耐藥情況日趨嚴重，對養豬行業及公共衛生造成重大威脅[2]。

四環素類抗生素是常用的廣譜抗生素，被廣泛應用于預防和治療革蘭氏陰性和陽性細菌的感染,是治療豬鏈球菌病最有效的抗生素之一[3]，2020年之前畜禽養殖業中，四環素常被用作抗菌促生長劑[4-5]。四環素(tetracycline)、多西環素(doxycycline)和米諾環素(minocycline)都是臨床常用四環素類抗生素，長期使用導致細菌對四環素類抗生素的耐藥性情況嚴峻。Hoa等[6]報道1997-2008年間從越南成年人腦脊液中分離的175株豬鏈球菌對四環素的耐藥性達到91%，黃文明等[7]報道了2010-2012年間廣東地區分離的豬鏈球菌對四環素類藥物的耐藥率高達98.2%。

四環素類抗生素耐藥機制主要為藥物外排和核糖體保護及滅活或鈍化四環素酶[8-9]，四環素耐藥基因多達四十多種，包括編碼外排泵的基因、編碼核糖體保護蛋白的基因及編碼滅活酶的基因[10-13]。細菌可通過獲得編碼相關蛋白的耐藥基因產生耐藥性[4,14]，耐藥基因的水平傳播被認為是細菌對抗生素耐藥的重要原因之一[15-16]。四環素類抗生素對豬鏈球菌耐藥機制包括：①由tetL、tetB、tetK或tet(40)基因介導的外排泵機制；②由tetO、tetM、tetS、tetW、tet(O/W/32/O)或tet(O/32/O)基因編碼核糖體保護蛋白機制[17]。Chen等[18]分離得到的豬鏈球菌中攜帶的耐藥基因主要為tetM、tetO、tet(O/W/32/O)、tet(O/32/O)、tetS、tetW、tetL、tet(40)；Petrocchi-Rilo等[19]報道西班牙分離的207株豬鏈球菌中有84.1%的菌株含耐藥基因tetO。

因此，了解細菌對四環素類抗生素的耐藥性及耐藥基因的攜帶情況對疾病的臨床用藥具有十分重要的意義。為了解廣東地區分離的豬鏈球菌對部分四環素類抗生素的耐藥情況及耐藥基因的攜帶情況，本研究調查了近幾年來廣東分離的34株豬鏈球菌對3種臨床常用四環素類抗生素的耐藥性，并分析了6種四環素耐藥基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX的攜帶情況，以期對臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2016-2020年從廣東不同地區分離的豬鏈球菌34株，其中9型鏈球菌19株，2型鏈球菌15株，保存于廣東省農業科學院動物衛生研究所豬病研究室，菌株具體來源信息如表1所示。

表1 豬鏈球菌菌株來源信息

1.1.2 主要試劑與儀器 四環素、多西環素、米諾環素藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)培養基(廣東環凱微生物技術有限公司)；2×PremixTaq、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；新生牛血清(廣州蕊特生物技術有限公司)。恒溫箱(PYX-DHS500,中國上海躍進醫療器械廠)；恒溫振蕩培養箱(ZWYR-2101C,中國上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 將凍存的細菌劃線接種于TSA平板上，于37 ℃恒溫箱中培養至長出單菌落，挑取單個菌落接種于TSB，于37 ℃振蕩培養6 h(本試驗所使用的TSB、TSA均加入了5%已滅活的新生牛血清)。

1.2.2 藥敏試驗 采用藥敏紙片擴散法(K-B法)檢測34株豬鏈球菌對3種四環素類抗生素的敏感性。取200 μL菌液，用無菌棉拭子均勻涂布在TSA平板上，然后用無菌鑷子夾取藥敏紙片，將其貼在平板表面，將平板放置于37 ℃恒溫箱中培養24 h后測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑及所使用的藥敏紙片判斷標準判定細菌對藥物的敏感性，判斷標準見表2。

表2 K-B試驗判斷標準

1.2.3 引物設計及合成 參照黃文明等[7]、王學君等[20]、關琳等[21]設計耐藥基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO、tetX引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表3。

表3 引物信息

1.2.4 耐藥基因檢測 將細菌接種于TSB培養基中，于37 ℃恒溫箱中振蕩培養12 h，收集細菌，用DNA提取試劑盒提取細菌DNA。用上述6種引物將提取的34株豬鏈球菌的DNA進行PCR檢測，將PCR檢測陽性產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。PCR反應體系25 μL：2×TaqMix 12.5 μL,DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表3)30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。反應結束后取10 μL反應產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結 果

2.1 34株豬鏈球菌對四環素類抗生素的敏感性檢測結果

34株豬鏈球菌對四環素、多西環素、米諾環素的耐藥率見表4。由表4可知，34株豬鏈球菌對四環素的耐藥率最高，為100%(34/34)，其次為米諾環素82.4%(28/34)、多西環素47.1%(16/34)。

表4 豬鏈球菌對四環素類抗生素的敏感性

2.2 耐藥基因的檢測結果

34株豬鏈球菌中，tetA、tetC、tetD、tetX基因PCR檢出率均為0；tetO和tetM基因PCR檢出率分別為100%(34/34)和14.7%(5/34)，且5株檢出tetM基因的菌株均為2型。tetO和tetM基因擴增片段大小分別為515和406 bp(圖1、2)，與預期結果相符，統計結果見表5。

表5 34株豬鏈球菌耐藥基因的攜帶情況

①A，2016-2017年樣品；B，2018-2020年樣品。②M，DL2000 DNA Marker；1～17，樣品；18，陰性對照。圖2同

PCR產物測序所得的核苷酸序列在NCBI上在線BLAST，結果顯示，與tetO基因核苷酸序列相似性最高的為D16-010262(MT383669.1，99.58%)，與基因tetM核苷酸序列相似性最高的為豬鏈球菌NJ3(CP082203.1，100%)。

圖2 tetM基因的PCR結果

2.3 34株豬鏈球菌對四環素類抗生素的耐藥基因和耐藥表型分析

各菌株的耐藥情況見表6。由表6可知，34株豬鏈球菌至少對1種四環素類抗生素耐藥，3重耐藥菌株有15株，占比44.1%(15/34)，其中9型豬鏈球菌10株，占比29.4%(10/34)，2型豬鏈球菌5株，占比14.7%(5/34)；2重耐藥菌株14株，占比41.1%(14/34)，其中9型豬鏈球菌9株，占比26.5%(9/34)，2型豬鏈球菌5株，占比14.7%(5/34)；只耐1種藥物的5株，占比14.7%(5/34)，5株全部為2型鏈球菌。2或3重耐藥菌株中9型豬鏈球菌為19株，占比55.9%(19/34)，2型豬鏈球菌10株，占比29.4%(10/34)，說明多重耐藥菌株中9型豬鏈球菌比例較高。2重耐藥菌株中耐四環素和米諾環素有13株，占比38.2%(13/34)，只有1株菌耐四環素和多西環素。

表6 豬鏈球菌耐藥情況統計

各菌株的耐藥基因攜帶情況見表7。由表7可知，同時攜帶tetO和tetM基因的菌株有5株，占比14.7%(5/34)，這5株菌全部為2型豬鏈球菌；單獨攜帶tetO基因的菌株有29株，占比85.3%(29/34)。

表7 各菌株的耐藥基因攜帶情況

3 討 論

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病病原，給養豬業造成重大經濟損失，并帶來嚴重的公共衛生安全[22]。抗生素作為治療豬鏈球菌的首選方法，常在養殖業中大量使用，但抗生素的廣泛應用及不合理使用導致細菌耐藥性問題日趨嚴重，給臨床治療帶來了困難。

四環素類抗生素是養殖業最常用的抗生素之一，耐藥情況也較為嚴峻。Arndt等[23]報道了加拿大安大略豬場分離的豬鏈球菌對四環素的耐藥性達84.2%；Ichikawa等[24]研究發現,日本東海地區的豬鏈球菌對四環素的耐藥性為80.7%；Yongkiettrakul等[1]研究報道泰國不同地區豬鏈球菌對四環素類藥物的普遍耐藥。本研究發現從廣東不同地區分離得到的34株豬鏈球菌對四環素、米諾環素和多西環素的耐藥率分別為100%(34/34)、82.4%(28/34)和47.1%(16/34)，說明廣東地區的豬鏈球菌對四環素類耐藥情況非常嚴重，僅有多西環素有較好的治療效果，但其耐藥率也已接近50%，因此臨床用藥時應盡量減少或謹慎使用該類抗生素。本研究發現四環素類藥物2或3重耐藥較為常見，34株豬鏈球菌中3重耐藥菌株占比達到44.1%(15/34)，2重耐藥菌株占比41.1%(14/34)，耐1種藥物的菌株占比14.7%(5/34)。本研究中多重耐藥菌株中9型豬鏈球菌比例較高，高達58.8%(20/34)，說明9型豬鏈球菌更容易造成耐藥，其機理尚未清楚，需進一步驗證和研究。

四環素類抗生素耐藥機制主要為藥物外排、核糖體保護及滅活或鈍化四環素酶等機制[5]，由不同tet耐藥基因決定。國內外對豬鏈球菌四環素耐藥基因的研究表明，tetO是豬鏈球菌中最常見的耐藥基因[17,25]。Aradanas等[26]研究報道了2013-2018年間分離的豬鏈球菌主要攜帶的耐藥基因為tetO。Tan等[27]研究表明，從江西省分離的豬鏈球菌對四環素的耐藥率較高，且tetO是主要的耐藥基因。本研究對外排泵機制相關的基因tetA、tetC和tetD，編碼核糖體保護蛋白的基因tetM和tetO，編碼滅活酶的基因tetX共6種不同耐藥機制相關基因分析發現，tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX基因攜帶率分別為0、0、0、14.7%(5/34)、100%(34/34)和0，說明廣東地區的豬鏈球菌主要攜帶的耐藥基因為tetM和tetO，提示這些豬鏈球菌分離菌株主要通過主動核糖體保護機制造成耐藥。不同血清型豬鏈球菌攜帶耐藥基因也存在一定的差異，許曉燕等[28]研究結果表明，中國大部分地區的2型豬鏈球菌對四環素具有很強的耐藥性，主要耐藥機制是由tetM基因介導的核糖體保護作用。關琳等[21]研究報道了9型豬鏈球菌對四環素的耐藥主要是由tetO基因介導。本研究發現34株鏈球菌都攜帶tetO基因，有5株菌同時攜帶tetO和tetM基因，且發現這5株豬鏈球菌全部為2型豬鏈球菌，其中機理有待于進一步研究和探討。

4 結 論

本研究結果表明，2016-2020年廣東不同地區分離的34株豬鏈球菌對四環素、米諾環素和多西環素的耐藥率分別為100%(34/34)、82.4%(28/34)和47.1%(16/34)，2重以上耐藥菌株占比較高。34株豬鏈球菌主要攜帶tetO和tetM基因，其中tetO基因攜帶率為100%，表明分離菌株對四環素類藥物的耐藥機制與tetO和tetM基因介導的核糖體保護蛋白有關。