廣東省部分地區馬腸道寄生蟲感染情況調查

梁穎欣，陳澤加，李繼超，崔曉曉，馮乾豈，李守軍，陳奡蕾

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2.廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州 510642；3.廣東省寵物工程技術研究中心，廣州 510642)

近年來馬術運動知名度逐漸提高，中國馬產業也迎來快速發展期。2020年，為推動中國馬產業發展，農業農村部及國家體育總局發布了《全國馬產業發展規劃(2020—2025)》，廣州市政府2021年與香港賽馬會簽署合作協議以推動大灣區馬產業發展[1]。馬匹健康管理對于馬產業尤為重要，其中馬匹寄生蟲感染是目前造成馬損失的最重要因素之一[2]。馬匹感染腸道寄生蟲后可表現不同程度的胃腸道癥狀、貧血、運動障礙等，嚴重時可導致馬匹死亡[2]。據國內外調查顯示，目前馬屬動物最常見的腸道寄生蟲感染類型為圓線蟲(Strongylusspp.)和馬副蛔蟲(Parascarisequorum)感染[2-4],此外，裸頭絳蟲(Anoplocephala)、韋氏類圓線蟲(Strongyloidewesteri)、馬蟯蟲(Oxyurisequi)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)等感染也常有報道[5-8]。隱孢子蟲為人畜共患病原體，其主要感染1歲內幼駒，同時也可感染幼齡兒童造成不同程度腹瀉[6]。

過去10年，國外研究者研究發現小圓線蟲和馬副蛔蟲出現了廣泛耐藥性[9-10]，并呼吁馬腸道寄生蟲的防控手段應由傳統的每年對全場馬匹進行多次驅蟲向基于糞便蟲卵計數(FEC)結果進行的選擇性治療轉變，以減少耐藥情況發生[11]。然而，國內針對馬屬動物腸道寄生蟲耐藥性研究較少，根據2013年鄭秋蕾[12]對14家山東馬術俱樂部的調查，部分馬術俱樂部中流行的圓線蟲已對伊維菌素產生耐藥性，提示中國應密切關注馬寄生蟲耐藥情況。

盡管中國有數千年的養馬歷史，擁有馬匹數量居世界前列[13]，但與歐美國家相比，中國目前針對馬腸道寄生蟲流行情況、防控情況和耐藥情況開展的研究相對較少，與此同時，現有研究的調查對象主要為傳統放牧地區的馬匹，對中國非傳統放牧地區馬匹的研究相對匱乏。針對這一現狀，本研究對廣東省內7座大灣區城市的24家馬術俱樂部展開調查，以期更深入地了解區域內相關情況，并為大灣區馬匹腸道寄生蟲病的防控提供相關參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于2021年6月至10月間，通過直腸掏取或揀拾新鮮糞便，采集廣東省大灣區內7個城市24個馬術俱樂部的馬糞，各馬術俱樂部在首次采樣前90 d內未實施集體驅蟲，同時所有受調查馬匹均健康且無胃腸道癥狀。本次調查共收集樣品375份，其中公馬40份，母馬159份，騸馬176份；<1歲馬5份，1～4歲馬42份，5～8歲馬123份，≥9歲馬205份。24家馬術俱樂部分別位于廣州(n=7)、深圳(n=6)、東莞(n=4)、佛山(n=2)、中山(n=2)、珠海(n=2)、惠州(n=1)。24家馬術俱樂部的存欄馬匹以成年馬(>4歲)為主，占受調查馬匹總數87.47%(328/375)。存欄馬匹性別以母馬及騸馬為主，參與調查馬匹中母馬、騸馬占比分別為42.40%(159/375)、46.93%(176/375)。在飼養環境方面，87.50%(21/24)的馬術俱樂部采用單間馬廄飼養，飼養期間不放牧，僅3家馬術俱樂部(廣州1、廣州2、佛山1場)在馬匹飼養期間放牧。各馬術俱樂部給予的馬飼料以干草配合精料為主，僅放牧俱樂部的馬能采食到鮮草。

1.2 蟲卵/卵囊檢查方法

1.2.1 飽和蔗糖溶液漂浮法 稱量10 g糞便樣品于50 mL離心管中，倒入約40 mL飽和蔗糖溶液并充分震蕩混合以釋放樣品中的寄生蟲卵/卵囊，靜置混合溶液至少30 min。用鐵絲環蘸取表層溶液印于潔凈的載玻片上，覆上蓋玻片后，在光學顯微鏡下觀察蟲卵/卵囊的形態結構特征，參考Adeppa等[14]的方法對蟲卵/卵囊進行鑒定。

1.2.2 飽和食鹽溶液漂浮法 每份樣品稱取2 g糞便于潔凈燒杯中，加入飽和食鹽水至60 mL，用玻璃棒充分攪拌，靜置1～2 min后，用膠頭滴管吸取液體加入麥氏蟲卵計數板左右計數室。靜置計數板2～5 min，在顯微鏡下觀察，按麥克馬斯特法[15]計算每克糞便中寄生蟲蟲卵/卵囊數(EPG/OPG)，每克糞便中的蟲卵/卵囊數=(左計數室蟲卵/卵囊數+右計數室蟲卵/卵囊數)×100。感染率(%)=陽性樣本數/樣本總數×100%。

1.3 糞便蟲卵減少計數試驗檢測驅蟲藥耐藥性

根據每克糞便中寄生蟲蟲卵數(EPG)，將樣本分為低排卵量樣本(EPG=0～199)、中排卵量樣本(EPG=200～500)和高排卵量樣本(EPG>500)[16]。對蟲卵初檢陽性且EPG>500的樣品進行糞便蟲卵減少計數試驗(FECRT)：以第一次糞便樣本EPG結果為第0天結果，初次采樣后3 d內分別用各馬術俱樂部常用驅蟲藥物(主要成分為伊維菌素、阿苯達唑)口服給藥1次，驅蟲后第14天再次采集糞便樣本檢測，比較2次檢測結果。根據Dauparaite等[9]的方法計算糞便蟲卵減少量(FECR，%)。FECR(%)=(第0天EPG―第14天EPG)×100/第0天EPG，若用藥后FECR<90%，則發生耐藥。

1.4 巢式PCR檢測幼駒隱孢子蟲感染情況

由于隱孢子蟲主要感染<1歲馬駒，因此對5份<1歲馬駒樣本進行隱孢子蟲檢測。根據張齊元[17]研究設計巢式PCR引物，引物詳細信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用基因組DNA提取試劑盒提取樣本蟲卵DNA，以提取的DNA為模板，采用巢式PCR方法檢測。

表1 引物信息

1.5 數據統計分析

應用SPSS 18.0軟件統計不同馬術俱樂部、城市、性別、年齡段感染情況，采用卡方檢驗比較不同年齡段、不同性別感染情況的差異。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 廣東省部分地區馬腸道寄生蟲感染總體情況

本次調查陽性樣本有120份，總陽性率為32.00%(120/375)。共檢出4種寄生蟲：圓線蟲、馬副蛔蟲、類圓線蟲及馬蟯蟲(圖1)，總感染率分別為30.40%、3.70%、0.80%和0.30%。70.83%(17/24)的馬術俱樂部為腸道寄生蟲陽性場，其中，來自6個馬術俱樂部的12份樣本存在2種或以上寄生蟲混合感染，其中8份樣本為圓線蟲和馬副蛔蟲混合感染；3份樣本為圓線蟲和類圓線蟲混合感染；1份樣本為圓線蟲、類圓線蟲、馬副蛔蟲3種混合感染。此外，僅在廣州1場檢出3例類圓線蟲，僅在東莞3場檢出1例馬蟯蟲。不同城市間，廣州市、深圳市、東莞市、佛山市、中山市、珠海市、惠州市的樣本腸道寄生蟲總陽性率分別為30.49%(25/82)、25.41%(31/122)、34.18%(27/79)、15.38%(2/13)、75.00%(12/16)、14.29%(3/21)、47.62%(20/42)(表2)。

表2 廣東省部分地區馬腸道寄生蟲的感染率

A，馬副蛔蟲卵(400×)；B，類圓線蟲卵(400×)；C，圓線蟲卵A(400×)；D，圓線蟲卵B(400×)；E，馬蟯蟲卵；F，馬副蛔蟲與圓線蟲混合感染(100×)

2.2 不同性別、年齡馬寄生蟲感染情況

由表3可知，公馬、母馬、騸馬總感染率分別為40.0%(16/40)、31.45%(50/159)、30.68%(54/176)，不同性別間總感染率差異不顯著(P>0.05)；不同性別間圓線蟲、馬副蛔蟲感染率差異均不顯著(P>0.05)。

表3 不同性別馬腸道寄生蟲感染率

由表4可知，1～4歲、5～8歲，≥9歲馬總感染率分別為53.19%(25/42)、30.89%(38/123)、27.80%(57/205)。1～4歲馬匹總感染率、圓線蟲感染率和馬副蛔蟲感染率顯著高于其他年齡段馬匹(P<0.05)。

表4 不同年齡段馬腸道寄生蟲感染率

2.3 感染強度統計

由表5可知，375份樣品中，總平均EPG為126.67。廣州市、深圳市、東莞市、佛山市、中山市、珠海市、惠州市的樣本平均EPG分別為168.29、68.03、87.34、107.69、725.00、23.81、119.05。受調查馬匹以低排卵量馬匹(EPG=0～199)為主，占馬匹總數83.47%(313/375)，其中，廣州、深圳、東莞、佛山、珠海、惠州地區的低排卵量馬匹占各地區受調查馬匹總數>78%，僅中山地區受調查馬匹以中高排卵量馬匹(EPG>200)為主，中高排卵量馬匹占該地區受調查馬匹總數56.25%(9/16)。所有受調查馬匹中僅25匹為高排卵量馬匹(EPG>500)，占馬匹總數6.67%(25/375)，主要分布在廣州地區(n=9)和中山地區(n=6)。24家馬術俱樂部中廣州1場和中山2場感染情況最嚴重，兩家馬術俱樂部超過40%的受檢馬匹為高排卵量馬匹，且平均EPG均>500。24家馬術俱樂部中共7家未檢出待檢寄生蟲，分別為廣州4、廣州6、廣州7、深圳2、東莞2、佛山1、珠海2場。

表5 廣東省部分地區馬腸道寄生蟲的感染強度統計

2.4 耐藥性試驗結果

耐藥性試驗共回收有效復檢樣本16份。16份樣本在初檢時EPG均>500，使用各樣本所在俱樂部的常用驅蟲藥(主要成分為伊維菌素、阿苯達唑)驅蟲1次后，在驅蟲后第14天回收樣本復檢。樣本復檢EPG都在0～100之間，用藥后FECR≥90%，表明各樣本所在俱樂部常用驅蟲藥驅蟲對本場馬匹有效，未見寄生蟲耐藥現象。

2.5 <1歲幼駒隱孢子蟲檢測結果

由圖2可知，5份<1歲馬幼駒樣本隱孢子蟲檢測結果均為陰性。

M，DL1500 DNA Marker；1～5，樣本；-，陰性對照；+，陽性對照

3 討 論

本研究通過檢測來自廣東省7座城市24家馬術俱樂部的馬糞便樣本，對廣東省部分地區馬腸道寄生蟲感染情況進行了調查。調查結果顯示，廣東省部分地區馬腸道寄生蟲總感染率為32.00%，與近年來國內外報道的部分放牧地區馬腸道寄生蟲總感染率(>80%)相比較低[4,18-19]，其原因可能與本省馬匹飼養方式以馬廄飼養為主，且存欄馬匹大部分為成年馬有關。與王思琦等[20]開展的針對廣東省部分地區賽馬腸道寄生蟲感染情況調查的結果相比，本次調查的總感染率是王思琦等[20]報道的3倍，其原因可能與2次調查的采樣時間、參與調查馬術俱樂部數量及采樣城市范圍的差異有關。同時，本次總感染率更接近魏梓霖等[2]針對全國15座城市賽馬的腸道寄生蟲的總感染率(33.5%)。由于本次調查覆蓋了7個廣東省大灣區城市，馬匹在采樣前至少3個月內未驅蟲且采樣時均無胃腸道不適，因此本次調查結果或許能體現常態下廣東省大灣區城市馬腸道寄生蟲感染情況。

Pfister等[11]研究表明，未成年馬(<4歲)比成年馬(>4歲)更易感寄生蟲。本次調查參考Pfister等[11]和鄭秋蕾[12]劃分馬匹年齡段的方式，將受調查馬匹按<1歲、1～4歲，5～8歲、≥9歲劃分，并分析各年齡段馬腸道寄生蟲感染率差異。根據分析結果可知，1～4歲馬匹的總感染率顯著高于其他年齡段馬匹，5～8歲和≥9歲馬匹的總感染率間無顯著差異，與鄭秋蕾[12]對山東省14家馬術俱樂部開展的調查中關于年齡段與感染率關系的分析結果相近。然而在分析性別對馬腸道寄生蟲感染率的影響時發現，不同性別馬的腸道寄生蟲總感染率無顯著差異。盡管幼駒(<1歲)被認為是馬腸道寄生蟲感染的高發群體[11]，但本次調查中的5匹<1歲幼駒均未檢測出圓線蟲、馬副蛔蟲、類圓線蟲、馬蟯蟲和隱孢子蟲，同時幼駒對應的母體亦未見前述寄生蟲感染。據訪問信息，上述母馬在圍產期均經歷過驅蟲，同時馬駒出生后一直和母馬生活在獨立馬廄中未與其他馬匹接觸。對于傳染病防控來說，隔離傳染源和阻斷傳播途徑是保護易感動物的有效方法。有報道指出，在母馬圍產期用驅蟲藥治療母馬可預防某些寄生蟲通過垂直傳播感染小馬駒[21]，同時母馬的乳汁也能為幼駒提供一定的免疫保護[22]。對于不便直接使用驅蟲藥物的幼齡馬駒，建議通過母馬圍產期用藥以控制母體的寄生蟲感染，隔離哺乳期母馬及新生馬駒以阻斷有可能的傳播途徑等措施來實現預防馬駒腸道寄生蟲感染的目標。針對EPG>500的馬匹，本調查進一步開展了寄生蟲耐藥性試驗，參與評估的16匹馬在使用本俱樂部常用驅蟲藥后，每克糞便蟲卵數減少至少90%，提示各俱樂部常用驅蟲藥對本俱樂部內流行寄生蟲仍有較好的驅蟲效果，未見明顯耐藥性。

Aromaa等[23]研究認為，提高馬廄清潔頻率和加強牧區環境衛生管理，可以降低圓線蟲和馬副蛔蟲感染率。本調查結果中圓線蟲、馬副蛔蟲的感染率明顯低于國內外牧區馬匹的報道[3,19]，這可能除了與本地區的非放牧管理模式有關，還要歸功于良好的衛生管理，本次參與調查的24個馬術俱樂部均每天至少安排2次糞便清理，7個未檢出寄生蟲卵的馬術俱樂部每日清理馬糞至少4次。然而，在對引進馬匹的管理方面，部分俱樂部稍顯松懈。以廣州1場、中山1場及中山2場為例，這3個馬術俱樂部的寄生蟲感染率、感染強度較高，廣州1場甚至出現了其他場沒有的類圓線蟲卵。結合訪問資料可知，廣州1場部分馬匹由北方牧區馬繁育場引進后，未經驅蟲和隔離就與馬群一起放牧飼養。而中山1場和中山2場雖然對引進后的馬匹實施分舍飼養，但馬匹到場后一直未驅蟲。研究指出，為預防馬匹遷移帶來的寄生蟲傳播風險，可在馬匹遷移前后利用有效的驅蟲藥物進行預防性治療[23]。因此建議區域內各馬術俱樂部在引進馬匹到場后應對其進行必要的隔離并盡快開展驅蟲工作，以防寄生蟲交叉感染。

近年來，全球馬寄生蟲耐藥性現象普遍存在，尤其是消化道線蟲對常用驅蟲藥物的耐藥現象日益突出[24]。國外調查顯示，過去10年間小圓線蟲和馬副蛔蟲出現了廣泛耐藥性[9,16]，馬匹使用伊維菌素驅蟲后的蟲卵再現期比過去有明顯縮短[24]。2013年美國馬獸醫協會(AAEP)發布了馬寄生蟲控制指南，建議通過FEC監測來制定“選擇性驅蟲治療(SAT)”計劃，以降低常見腸道寄生蟲耐藥性發展速度[25]。根據SAT流程，對于單匹或小群體內的成年馬，若無明顯的胃腸道癥狀，僅當它們的EPG>200時才給予驅蟲藥治療[11]。本次調研的24家馬術俱樂部此前均未進行過FEC監測，采用的驅蟲方案仍遵照國際傳統驅蟲方案，使用主要成分為伊維菌素、阿苯達唑的驅蟲藥對全場馬匹進行每年2或4次的集體驅蟲[26]。然而考慮到本省馬匹飼養方式與牧區馬匹飼養方式存在較大差異，傳統的全年多次集體驅蟲方案可能不是本省馬匹的最佳預防策略。結合本次調查結果，省內存欄馬匹以成年馬為主，受調查時均無臨床癥狀且感染強度呈低排卵量，本地區可能更適合采取基于FEC結果而制定SAT方案。雖然這樣可能會為各馬術俱樂部增加一定的工作量，但長遠來看，該策略不僅能避免過度使用驅蟲藥，減緩寄生蟲耐藥性進程，還能監測用藥效果和場地流行寄生蟲耐藥情況，是一種更具優勢的驅蟲方案。

4 結 論

本次調查結果顯示，廣東省部分地區馬腸道寄生蟲總感染率為32.00%，感染以圓線蟲和馬副蛔蟲為主；1～4歲馬比>4歲馬更易感染圓線蟲或馬副蛔蟲，但不同性別間感染率無顯著差異；受調查的廣東省部分地區馬腸道寄生蟲感染強度相對較低。上述結果提示，目前廣東省內馬匹腸道寄生蟲防控總體良好，但仍需要加強對寄生蟲的定期監測。本研究結果可為廣東省馬匹寄生蟲病的防控提供科學依據。