奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激模型的建立及奶牛脂肪間充質干細胞對其遷移的影響

魯文賡，司琳清，田春雨，袁思琦，謝何昕，周繼偉，金吉東，韓英浩

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.榆樹市農業綜合行政執法大隊，榆樹 130400；3.科菲特飼料(長春)有限公司，長春 130012；4.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319)

奶牛在圍產期特別是產后其抗氧化能力降低，為滿足分娩和泌乳等生理活動需求其代謝增加，高代謝水平將導致活性氧(ROS)產生增多，ROS的產生與抗氧化能力之間的不平衡促使氧化應激發生，繼而影響子宮健康并促進子宮內膜炎的發生發展。研究表明，奶牛的急性子宮感染與脂質過氧化水平升高和抗氧化能力下降有關[1-4]。子宮內膜感染后，中性粒細胞到達子宮內吞噬病原體產生大量的ROS會通過激活促炎因子的轉錄來加劇炎癥反應，并使蛋白質、脂質和DNA氧化，進而造成子宮內膜上皮細胞死亡，加重組織損傷[5-7]。因此，修復奶牛子宮內膜上皮的氧化損傷對子宮內膜炎的防治十分關鍵。盡管損傷后的組織修復和再生機制尚未明確，但相關研究表明其涉及細胞遷移和增殖、細胞外基質重塑等，而細胞外調節蛋白激酶(Erk)是信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵分子，參與調節細胞分化、增殖、遷移等多種生命活動[8]。

間充質干細胞(MSCs)是由成體組織基質中獲得的具有再生功能的多能干細胞，在損傷修復中發揮著重要的生物學功能[9]。張延玲[10]研究表明，月經血中子宮內膜來源MSCs可以修復損傷子宮并通過激活Erk來促進臍內皮細胞的遷移。隨著現代醫學對MSCs的深入研究，其在動物臨床中的研究也愈加廣泛，詹小舒等[11]研究發現，犬臍帶MSCs來源的外泌體可以促進血管內皮細胞遷移；在奶牛中的研究發現，骨髓和脂肪MSCs的條件培養基均可在體外抑制金黃色葡萄球菌的活性，為獸醫臨床中奶牛乳腺炎的治療提供理論基礎[12-13]。Lu等[14]研究發現，使用脂多糖(LPS)誘導體外奶牛子宮內膜炎模型后與奶牛脂肪間充質干細胞(bAD-MSCs)共培養可以顯著抑制炎性反應與細胞凋亡，但bAD-MSCs對氧化應激導致奶牛子宮內膜上皮細胞損傷的作用還不清楚。由于H2O2會使細胞氧化并產生具有高度活性的自由基，被廣泛用于細胞氧化應激模型的構建[15]。本試驗使用H2O2構建奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激模型并探討bAD-MSCs是否可以促進氧化應激狀態下奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移，以期為臨床上防治由氧化應激導致的奶牛子宮內膜上皮損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F12購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自四季青公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素、MTT試劑、活性氧檢測試劑盒、ECL顯影液均購自Solarbio公司；H2O2購自Simga公司；Erk抗體、pErk抗體、β-actin抗體均購自Santa公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG二抗購自BioBasic公司。

1.1.2 主要儀器 細胞培養箱(CB160)購自Binder公司；酶標儀(Elx800)購自BioTek公司；流式細胞儀(CytoFLEX)購自Beckman公司；蛋白成像系統(Amersham Imager 600)購自Cytiva公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的復蘇與傳代培養 將黑龍江八一農墾大學動物產科學實驗室分離培養并鑒定的原代bAD-MSCs與奶牛子宮內膜上皮細胞復蘇并接種至培養皿中，待細胞匯合度達到80%～90%時，使用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，待大部分細胞從培養皿底部脫落下來時，加入含10% FBS的培養基終止消化。隨后將終止消化的細胞懸液以1 000 r/min離心3 min并重懸，以1∶2進行傳代培養，使用第4代細胞進行后續試驗。

1.2.2 H2O2誘導奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激最佳濃度篩選 將奶牛子宮內膜上皮細胞以每孔1×104個接種于96孔板中，待細胞匯合度為80%～90%時，棄去培養液，分別加入含有0(對照組)、5、25、50、100、200 μmol/L H2O2的培養基(DMEM/F12+1% FBS)，分別刺激2、4、6、8、12 h，每組3個重復。在每孔中加入5 g/L MTT溶液10 μL，于37 ℃培養箱中避光孵育2 h，每孔加入100 μL細胞級二甲基亞砜(DMSO)溶液，于37 ℃培養箱中避光孵育10 min，測定各組D490 nm值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(試驗組D490 nm/對照組D490 nm)×100%。

1.2.3 H2O2誘導奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激最佳時間篩選 將奶牛子宮內膜上皮細胞以每孔2.5×105個接種于6孔板中，待細胞匯合度為80%～90%時，棄培養液，對照組加入不含H2O2的培養基，H2O2刺激組加入含50 μmol/L H2O2培養基，在2、4、6、8、12 h收集細胞，使用PBS充分洗滌，離心后加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針重懸細胞，37 ℃避光孵育15 min，用PBS洗掉多余探針，用流式細胞儀在激發光488 nm、發射光525 nm下檢測熒光強度。

1.2.4 bAD-MSCs對氧化應激狀態下奶牛子宮內膜上皮細胞遷移的影響 將奶牛子宮內膜上皮細胞以每孔2×105個接種于6孔板中，待細胞匯合度為80%～90%時，棄培養液，對照組加入無H2O2的培養基，試驗組加入50 μmol/L H2O2的培養基，2 h后使用200 μL槍頭均勻劃線，用PBS洗去死細胞，拍照記錄，此時記為劃痕0 h。將培養基全部更換為無H2O2的培養基，試驗組使用孔徑為0.4 μm的transwell，根據與奶牛子宮內膜上皮細胞共培養的細胞類型及小室接種細胞的密度構建不同的間接共培養體系，分為對照組、H2O2組、H2O2處理奶牛子宮內膜上皮細胞與bAD-MSCs按1∶0.5、1∶1共培養組(H2O2+bAD-MSCs(1∶0.5)組、H2O2+bAD-MSCs(1∶1)組)、H2O2處理奶牛子宮內膜上皮細胞與奶牛乳腺上皮細胞(MACT)按1∶0.5、1∶1共培養組(H2O2+MACT(1∶0.5)組、H2O2+MACT(1∶1))組6組，按以上順序記為1、2、3、4、5、6，24 h后拍照記錄，記為劃痕24 h。使用ImageJ v1.51測量劃痕之間的面積，分別與各組劃痕0 h比較評估細胞遷移能力。

1.2.5 bAD-MSCs對氧化應激狀態下奶牛子宮內膜上皮細胞中Erk蛋白表達水平的影響 收集1.2.4中各組奶牛子宮內膜上皮細胞，使用RIPA裂解液提取蛋白，使用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，根據蛋白濃度計算蛋白上樣量，蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合，每孔上樣量為15 μL，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法轉移至NC膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉1 h，與β-actin(1∶1 000)、Erk(1∶1 000)、pErk(1∶1 000)抗體4 ℃過夜孵育，室溫下使用HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶3 000)孵育1 h，曝光顯影，利用ImageJ v1.51統計灰度值，計算pErk與Erk的比值表示pErk蛋白的相對表達量。

1.3 數據統計分析

用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用鄧肯氏多重比較，結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行繪圖。

2 結 果

2.1 H2O2誘導奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激最佳濃度的篩選

由圖1可知，5 μmol/L H2O2刺激奶牛子宮內膜上皮細胞2 h時，細胞存活率顯著高于對照組(P<0.05)，4、6、8、12 h組細胞存活率均低于對照組(P<0.05)；25、50、100、200 μmol/L H2O2組細胞存活率均低于對照組(P<0.05)，分別為70%～90%、50%～80%、10%～60%、10%～30%。因此，選取50 μmol/L H2O2構建氧化應激模型。

與0 μmol/L H2O2組相比，*,差異顯著(P<0.05)

2.2 H2O2誘導奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激最佳時間的篩選

由圖2可知，用50 μmol/L H2O2刺激2 h時，細胞內ROS水平顯著高于對照組(P<0.05)，4、6、8、12 h組ROS水平均顯著低于2 h組(P<0.05)。因此，后續試驗選取50 μmol/L H2O2刺激2 h構建奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激模型。

①A,流式細胞術檢測ROS的生成情況；B,ROS生成定量分析。②肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.3 bAD-MSCs對氧化應激狀態下奶牛子宮內膜上皮細胞遷移的影響

由圖3、4可知，與對照組相比，50 μmol/L H2O2組奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移能力顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，bAD-MSCs共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移能力均顯著增加(P<0.05)，MACT共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移能力均顯著降低(P<0.05)，且1∶0.5 bAD-MSCs和1∶1 MACT共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移能力分別顯著低于1∶1 bAD-MSCs和1∶0.5 MACT共培養組(P<0.05)。

1,對照組；2，H2O2組；3，H2O2+bAD-MSCs(1∶0.5)組；4，H2O2+bAD-MSCs(1∶1)組；5，H2O2+MACT(1∶0.5)組；6，H2O2+MACT(1∶1)組。圖4、5同

圖4 各組奶牛子宮內膜上皮細胞劃痕間面積定量分析

2.4 bAD-MSCs對氧化應激狀態下奶牛子宮內膜上皮細胞中Erk蛋白表達水平的影響

由圖5可知，與對照組相比，50 μmol/L H2O2組奶牛子宮內膜上皮細胞中pErk蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，bAD-MSCs共培組奶牛子宮內膜上皮細胞中pErk蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，MACT共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞中pErk蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，且1∶0.5 bAD-MSCs和1∶1 MACT共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞中pErk蛋白表達水平分別顯著低于1∶1 bAD-MSCs和1∶0.5 MACT共培養組(P<0.05)。

A,pErk、Erk蛋白Western blotting檢測；B，pErk和Erk蛋白比值

3 討 論

氧化應激是指機體內ROS生成過多、抗氧化能力下降造成的細胞及組織損傷，奶牛在圍產期經歷了營養、激素等多種變化導致機體內ROS產生增多，使子宮內膜上皮細胞的結構和功能被破壞，從而易于被病原微生物感染。當細菌侵入子宮內膜后，中性粒細胞首先到達炎癥部位去吞噬病原微生物，在這個過程中會產生大量ROS，此時ROS除了會造成細胞組織損傷外，還會通過激活細胞信號級聯促進白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6等促炎細胞因子，加劇炎癥反應，所以對ROS造成細胞及組織損傷的修復對疾病的治療也十分重要，但此過程在體外模擬較為困難。H2O2作為一種常見的ROS，通常被用于探究自由基介導的氧化損傷機制及抗氧化劑對氧化損傷的修復機制，因此本研究選擇H2O2作為奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激模型的應激源。細胞存活率和細胞內ROS水平是評估造模是否成功的關鍵指標，最佳的造模條件既要極大程度減輕細胞損傷又要使ROS水平顯著升高，目前的試驗結果顯示50%～80%的細胞存活率均可以造模成功[16-18]。本試驗結果發現，5 μmol/L H2O2刺激2 h時，細胞存活率高于100%，這是因為H2O2在低濃度時可以作為第二信使刺激細胞增殖[19-22]，H2O2濃度為25、50、100、200 μmol/L時細胞存活率分別為70%～90%、50%～80%、10%～60%、10%～30%，細胞存活率低于50%時細胞大量死亡且形成不可逆損傷，不適合作為造模條件[21]，因此本試驗最終選擇用50 μmol/L H2O2作為最佳刺激濃度。為了進一步篩選最佳作用時間，本試驗使用流式細胞術檢測細胞內ROS水平，結果表明，在2 h時細胞內ROS水平較對照組顯著升高，而4、6、8、12 h組較2 h組呈現出降低的結果，這是由于ROS僅在活細胞中可以檢測出，隨著作用時間延長，奶牛子宮內膜上皮細胞的存活率逐漸降低，ROS含量下降，僅能說明活細胞中的ROS含量下降，這并不能代表由H2O2刺激產生總ROS的含量[22]。本研究使用50 μmol/L H2O2刺激奶牛子宮內膜上皮細胞2 h來構建氧化應激模型并進行后續試驗。這與張夢龍[23]、趙璧忱[24]得出的400 μmol/L H2O2刺激2 h有所區別，可能是由于H2O2化學性質活潑、不穩定，且不同的儲存方式與其化學活性也息息相關，因此關于構建氧化應激模型的濃度和時間在不同實驗室之間均存在較大的差異。另外，細胞的不同培養方法也可能會影響其對H2O2的耐受性，如不同的細胞培養液、凍存液及細胞在培養皿(瓶)的匯合度等。

MSCs作為一種多能干細胞，在現代臨床醫學中已被廣泛應用于組織再生和自身免疫性疾病的治療[25]，MSCs主要通過以下2種方式實現損傷組織的修復，第一種是通過其歸巢能力遷移到受損部位發揮其功能[26]，但是移植MSCs在臨床上具有一定風險與挑戰，移植細胞存活率低、免疫排斥反應、到達損傷部位時間長，甚至動脈內注射MSCs可導致心肌微梗死的發生[27]；第二種是通過其旁分泌功能促進細胞的增殖遷移進而使受損組織或器官得以修復[28]。所以本研究使用細胞劃痕試驗并通過transwell構建共培養體系來探究bAD-MSCs是否可以通過旁分泌作用對氧化應激狀態下奶牛子宮內膜上皮細胞遷移起到積極作用。試驗結果表明，與對照組相比，H2O2刺激降低了奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移能力，而與H2O2組相比，bAD-MSCs共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移能力顯著增強，這可能是因為MSCs通過其旁分泌作用產生了豐富的生物活性分子，包括生長因子、趨化因子、細胞因子和小細胞外囊泡(如外泌體)等介質來調節免疫反應和損傷組織的修復。而MACT共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞表現為遷移能力降低，這是因為在MACT共培養組中劃痕處有大量細胞壞死，脫離培養板底部，使劃痕之間的面積增加，另外未發生氧化應激的MACT也可能會競爭性地吸收培養基中的營養成分，加劇細胞壞死進程。

研究發現，Erk蛋白參與調控多種生理病理過程中的細胞增殖與遷移[29-30]，Shabbir等[31]研究證明，MSCs的外泌體可以通過Erk1/2信號通路促進正常和慢性創傷性成纖維細胞的遷移。本研究結果顯示，bAD-MSCs共培養組奶牛子宮內膜上皮細胞中pErk蛋白水平較H2O2組顯著升高，但是與對照組相比，其遷移能力較高，pErk蛋白水平卻較低，這提示MSCs的旁分泌功能對細胞遷移的影響不僅是通過調控Erk信號通路來實現的。有研究表明，MSCs可以通過旁分泌作用激活多種與傷口愈合相關的信號通路，如蛋白激酶B(Akt)、Erk、細胞信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)，并誘導多種營養因子的表達。特別是MSCs外泌體中含有STAT3，STAT3通過誘導大量基因表達以調控細胞增殖、遷移和血管生成，包括參與細胞周期控制的骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(c-myc)、細胞周期蛋白(cyclin)、IL-6、肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)[32-33]，但其中所涉及的活性分子較多，機制復雜，且不同來源的MSCs分泌的活性分子在種類與含量上均存在一定的差異，所以關于其具體的活性分子及調控機制需要進一步深入探究。

4 結 論

本試驗結果表明，用50 μmol/L H2O2刺激2 h可成功構建奶牛子宮內膜上皮細胞氧化應激模型。bAD-MSCs可以促進氧化應激狀態下奶牛子宮內膜上皮細胞的遷移，且參與調控Erk蛋白的表達。結果為臨床上治療由子宮感染造成的奶牛子宮內膜上皮細胞氧化損傷提供了新的思路。