一株葡萄白腐病拮抗放線菌的篩選及鑒定

馬 光，蘇長青，高小寬，呂亞慈，李會芬

（衡水學院生命科學系 河北衡水 053000）

葡萄白腐病是一種常見病害，在世界范圍內均有發生。我國各葡萄產區也有發現，而且近年來此病害發生更加普遍。葡萄白腐病早期癥狀表現為果實上的棕色圓形腐爛病變，隨著病情的發展，腐爛區逐漸擴大，最后使果實完全腐爛失去商品價值。在潮濕的條件下，在病變上形成黑色子實體和白色分生孢子。葡萄白腐病是由半知菌亞門墊殼孢屬Petr. & Syd 引起的[1]。傳統的葡萄白腐病防治是在加強田間管理的基礎上進行化學藥劑防治。隨著環保觀念的深入人心，無公害生物農藥在葡萄生產中的應用呈逐年上升趨勢。本文通過拮抗性篩選，獲得了一株對葡萄白腐病具有良好拮抗作用和防治效果的放線菌菌株K5，并通過形態學和16S rDNA 的方法對其分類進行了鑒定，為葡萄白腐病的生物防治提供了優良的微生物種質資源。

1 材料與方法

1.1 土壤放線菌的分離 錐形瓶中加入90 mL 無菌水和取自葡萄園的土壤10 g，120 r/min 振蕩25 min后室溫靜置10 min。取上清1 mL 加入無菌水9 mL。梯度稀釋分別制備成1/100，1/1000，1/10000，1/100000 不同濃度的稀釋液。取0.1 mL 不同濃度的稀釋液均勻涂布到固體高氏一號的培養基表面。28 ℃培養5 d 后挑取沒有染菌，單個形態不同菌落接種至試管斜面放入培養箱28 ℃進行培養。

1.2 拮抗放線菌的篩選 挑選試管里長勢良好、無污染、形態各異的菌種分別和實驗室保存的葡萄白腐病菌種一起在PDA 培養基上相距2 cm 左右劃線，將培養皿放到恒溫培養箱中28 ℃倒置培養。5 d 后測量葡萄白腐病菌的直徑大小，計算抑菌率，具體計算方法見參考文獻[2]。

1.3 拮抗放線菌防治葡萄白腐病的離體果試驗 選取成熟度和大小一致的巨峰葡萄果實，每處理選10 顆葡萄果實。處理1：噴發酵原液50 倍稀釋液，24 h 后再刺傷接種葡萄白腐病菌；處理2：刺傷接種白腐病菌24 h后再噴發酵原液50 倍稀釋液；對照：果實噴無菌水。28 ℃條件下保濕3 d 后調查病情指數，計算方法見參考文獻[3]。

1.4 拮抗放線菌株的鑒定 根據菌落特征和16S rDNA 鑒定。提取放線菌基因組總DNA，以總DNA為模板，采用通用引物27F 和1492R（序列分別為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增其16S rDNA。94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35 個循環，72 ℃延伸10 min 一個循環，4 ℃保存。PCR產物純化后測序，將測定結果進行在線Blastn比對，比對庫選擇16S rRNA，比對結果以系統發育樹的形式進行展示，確定與所篩選菌株分支最近的物種以最終確定所篩選到的放線菌菌株的種屬。

2 結果與分析

2.1 平板對峙法篩選拮抗葡萄白腐病的放線菌 利用稀釋平板分離的方法獲得了9 株放線菌，分別編號為K1-K9，將其與葡萄白腐病病菌一起培養進行平板對峙試驗。計算抑菌率表明K5 對葡萄白腐病菌有很強抑制作用，其抑菌率達到了62.56%，顯著高于其他8 株（圖1）。培養皿內K5 產生了明顯的抑菌帶，在K5 附近葡萄白腐病菌菌絲不能生長。

圖1 放線菌拮抗葡萄白腐病的平板對峙培養抑菌率

2.2 拮抗放線菌對離體果葡萄白腐病的防治效果從表1 可以看出，處理1 葡萄果實的病情指數總體小于處理2，從相對防效來看，處理1 也好于處理2。從不同拮抗菌株來看，平板對峙試驗中對葡萄白腐病菌抑制作用較強的防線菌株K5 相對防效最好，顯著好于其它8 株放線菌。

表1 放線菌防治離體果葡萄白腐病效果

2.3 拮抗放線菌菌株K5 的鑒定 對葡萄白腐病菌抑制作用最強的菌株K5 菌落特征為：菌落小而致密，菌絲致密微小。剛開始生長時，菌體呈較干而且不透明的狀態，顏色為單一的白色，邊緣整齊且表面光滑，黏著性強、用接種針很難挑起。而后，逐漸生長成為絨毛狀、表面起粉、色澤逐漸豐富。在培養基上可裂生大量分生孢子進行散播、繁殖。初步判定為鏈霉菌。

以放線菌16s rDNA 通用引物和篩選得到的菌株K5 總DNA分別作為引物和模板進行PCR擴增反應。得到單一擴增條帶，將測序結果在NCBI 16s rRNA 數據中進行比對，比對結果的系統發育樹表明K5 與淡紫灰鏈霉菌聚為一支（圖2）。結合菌株K5 的形態學鑒定將菌株K5 鑒定為鏈霉菌，可確定篩選到的拮抗放線菌菌株K5 為淡紫灰鏈霉菌。

圖2 K5 菌株16S rDNA 的系統發育樹

3 結論與討論

篩選對葡萄白腐病具有顯著拮抗作用的菌株，研制生物農藥也越來越受到重視。拮抗菌株的篩選以及生物農藥在葡萄上的應用已經多有報道，解淀粉芽孢桿菌、放線菌[4]等對葡萄霜霉病病菌有拮抗作用。在對葡萄灰霉病的研究中發現假絲酵母菌（對紅提葡萄灰霉病具有明顯的抑制作用[5]。在葡萄白腐病的拮抗菌株篩選研究中也發現了幾種有較強抑菌作用的菌株[6-7]，但數量還相對較少。本研究通過形態學和16S rDNA分類對葡萄園土壤中分離到的1 株對葡萄白腐病菌具有較好抑菌效果的菌株進行了鑒定，確定其為淡紫灰鏈霉菌，豐富了葡萄白腐病生物防治的微生物菌種資源。為使該菌株能夠真正在葡萄生產中得到應用，應繼續對其抑菌機理、發酵條件以及生物藥劑配方進行進一步深入研究。