原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)高效液相色譜法方法驗(yàn)證

寇永麗，郭 瑞

（大同市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西 大同 037000）

2008 年的“三聚氰胺事件”轟動(dòng)全國(guó),產(chǎn)生了惡劣的社會(huì)影響。三聚氰胺（melamine），化學(xué)式為C3N3（NH2）3，被命名為1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺,是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，三聚氰胺分子中含氮量達(dá)66.7%,一些不法企業(yè)將其添加到牛奶、乳制品中,造成粗蛋白質(zhì)虛高的假相,不僅對(duì)乳制品、養(yǎng)殖業(yè)等產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生不利影響,對(duì)人類(lèi)健康也構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。臨床試驗(yàn)表明，動(dòng)物長(zhǎng)期攝入三聚氰胺會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害及腎結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌[2]。目前，三聚氰胺已嚴(yán)禁直接用于食品。國(guó)家頒布法律法規(guī)強(qiáng)調(diào)企業(yè)在購(gòu)入生乳原料和原料乳粉及其加工制品時(shí)需檢測(cè)三聚氰胺含量[3-4]。國(guó)家質(zhì)檢總局出臺(tái)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法：《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》（GB/T 22388—2008）和《原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)液相色譜法》（GB/T 22400—2008）。

通過(guò)陽(yáng)性添加回收試驗(yàn)驗(yàn)證《原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)液相色譜法》（GB/T 22400—2008）的精密度、重復(fù)性、回收率、檢測(cè)限，得出GB/T 22400-2008方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)生鮮乳中三聚氰胺含量進(jìn)行檢測(cè)，適合應(yīng)用于大批量檢測(cè)。

1 試驗(yàn)流程

使用方法為《原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)液相色譜法》（GB/T 22400—2008）。待測(cè)樣品經(jīng)乙腈的提取后[5]，經(jīng)陽(yáng)離子交換色譜柱分離，經(jīng)有機(jī)濾頭過(guò)濾后，用高效液相色譜檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)試劑與材料

供檢測(cè)樣品為某地區(qū)生鮮乳；乙腈（色譜純），默克化工技術(shù)（上海）有限公司生產(chǎn)；磷酸（優(yōu)級(jí)純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；磷酸二氫鉀（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），阿爾塔科技有限公司生產(chǎn)。

磷酸鹽緩沖液：準(zhǔn)確稱(chēng)取6.8 g（精確至0.01 g）磷酸二氫鉀，加入約800 mL 水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.0，定容至1 L，過(guò)濾膜抽濾后備用。

2.2 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（Waters e2695），沃特斯科技（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)；多管渦旋振蕩器，北京踏錦科技有限公司生產(chǎn)；分析天平（MS303TS），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱(chēng)取100 mg（精確至0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用水完全溶解后，100 mL 容量瓶中定容至刻度，混勻，即可得到1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水適當(dāng)稀釋?zhuān)玫?00 mg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。

將100 mg/L 的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，用水適當(dāng)稀釋后制得濃度為0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L 的三聚氰胺系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4 儀器參數(shù)

2.4.1 色譜柱

SCX 柱，250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑），5 μm，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

2.4.2 參數(shù)設(shè)置

進(jìn)樣量：20 μL；波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：40℃；流速：1 mL/min。

2.4.3 流動(dòng)相

磷酸鹽緩沖液-乙腈（70+30，體積比）。

2.5 具體步驟

稱(chēng)取15 g（精確至0.01 g）生鮮乳試樣于50 mL離心管中，加入30 mL 乙腈，劇烈震蕩6 min，加水定容至滿刻度，充分混勻后靜置3 min，用一次性注射器吸取上清液0.22 μm 有機(jī)濾頭過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 工作曲線

配制濃度為0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L 的三聚氰胺系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，得到2條標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1、圖2）：標(biāo)準(zhǔn)曲線（低濃度）、標(biāo)準(zhǔn)曲線（高濃度）。

圖1 三聚氰胺低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.1 The standard working curve of low concentration of melamine

圖2 三聚氰胺高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.2 The standard working curve of high concentration of melamine

結(jié)果表明，三聚氰胺分別在0.005～0.2 mg/L、0.2～50.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性方程分別為：

3.2 檢出限

方法中給出檢出限為0.05 mg/kg，進(jìn)行了6次平行添加試驗(yàn)，結(jié)果均可檢出，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三聚氰胺方法檢出限陽(yáng)性添加回收試驗(yàn)Tab.1 The melamine method detection limit positive addition recovery

3.3 定量限

取三聚氰胺陰性生鮮乳15 g，加入濃度為10.0 mg/L 的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液750 μL，獲得添加濃度為0.5 mg/kg的待測(cè)樣品,添加同樣的待測(cè)樣6 個(gè)平行，按照2.5 具體步驟樣品進(jìn)行前處理，測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明，三聚氰胺的平均回收率為90.0%，RSD值為1.04%，說(shuō)明此方法可以對(duì)陽(yáng)性含量為0.5 mg/kg的試樣準(zhǔn)確定量。

表2 三聚氰胺定量限陽(yáng)性添加回收試驗(yàn)（n=6）Tab.2 The melamine quantitative limit positive addition recovery test

3.4 精密度

取三聚氰胺陰性生鮮乳15 g，加入濃度為10.0 mg/L 的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液1.50 mL，獲得添加濃度為1.0 mg/kg 的待測(cè)樣品，添加同樣的待測(cè)樣6 個(gè)平行，按照2.5 具體步驟樣品進(jìn)行前處理，測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明，三聚氰胺的平均回收率為96.7%，RSD值為6.16%，精密度良好。

表3 三聚氰胺精密度陽(yáng)性添加回收試驗(yàn)（n=6）Tab.3 The melamine precision positive addition recovery test

3.5 重復(fù)性

表4 三聚氰胺重復(fù)性陽(yáng)性添加回收試驗(yàn)（n=6）Tab.4 The melamine repeated positive addition recovery test

取三聚氰胺陰性生鮮乳15 g，加入濃度為100.0 mg/L 的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液750 μL，獲得添加濃度為5.0 mg/kg的待測(cè)樣品，添加同樣的待測(cè)樣6 個(gè)平行，按照2.5 具體步驟樣品進(jìn)行前處理，測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果表明，三聚氰胺的平均回收率為96.0%，RSD值為6.26%，重復(fù)性良好。

4 結(jié)論

通過(guò)陽(yáng)性添加回收試驗(yàn)，對(duì)《原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)液相色譜法》（GB/T 22400—2008）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法的精密度、重復(fù)性良好；在添加濃度為0.5～5 mg/kg時(shí)，平均回收率可達(dá)到90%以上；陽(yáng)性添加檢測(cè)限濃度均可檢出；陽(yáng)性添加定量限濃度均可準(zhǔn)確定量。因此，得出GB/T 22400—2008方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)生鮮乳中三聚氰胺含量進(jìn)行檢測(cè)，適合應(yīng)用于大批量檢測(cè)。