單因素實驗法優化韭菜籽中皂苷提取工藝

沈 婧

（蘇州市產品質量監督檢驗院，江蘇蘇州 215000）

我國的韭菜籽儲備十分充足，作為行氣理血、溫補腎陽的食材，用于食療入藥已有超過千年的傳統歷史。而迄今為止，民間篤信的韭菜籽滋補肝腎、抗疲勞功能還未有過真實可靠的書面報道，其藥效或藥理研究也是寥寥無幾[1]。高效分離出韭菜籽中有效成分對于今后研究者或是藥物研發單位都有著十分重要的意義[2]。本研究利用分光比色法探究優化韭菜籽中皂苷的提取工藝，提純出韭菜籽中抗疲勞成分，為發揮其功能性物質成分的作用奠定基礎[3]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

RE52CS 旋轉蒸發器，上海亞榮生化；HH-2 數顯恒溫水浴鍋，金壇市榮化；WFJ UV-2000 紫外可見分光光度計，尤尼柯；EL204 電子分析天平，上海梅特勒-托利多。

1.2 材料與試劑

95%工業酒精；無水乙醇、冰醋酸、高氯酸和香草醛，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 韭菜籽中皂苷提取工藝

目前國內從中草藥中提取活性成分的工藝主要有溶劑萃取法、沉淀法、鹽析法、透析法等。桑圣明等[4]用溶劑萃取法從韭菜籽中分離確認出生物堿、皂苷類以及酰胺類化合物。溶劑萃取法中溶劑的挑選，要滿足對目標物溶解度大、對非目標物溶解度小的要求，依據這一點性質將目標物從中草藥中溶解出來[5]。粉碎好的中草藥泡在選好的溶劑中時，通過擴散作用，溶劑分子透過細胞壁滲入草藥組織細胞內，溶解目標物，使得細胞內目標物濃度大于細胞外，構成了濃度差，于是細胞內高濃度溶液不斷透過細胞壁向細胞外擴散，同時細胞外的低濃度溶劑又滲入組織細胞內。本研究選用酒精作為溶劑提取韭菜籽中的皂苷，并用分光比色法測定總皂苷的含量。

1.3.2 提取工藝的單因素實驗探究

用破壁機將干燥的韭菜籽打成韭菜籽粉末，過4號篩，備用。

（1）酒精濃度單因素實驗。準備6 個150 mL 干凈的具塞玻璃錐形瓶，準確稱取6 份0.2 g（精確到小數點后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。用量筒量取50 mL 的純凈水以及30%vol、40%vol、50%vol、55%vol 和60%vol 的酒精溶液，分別加入6 個錐形瓶中，搖勻。在20 ℃恒溫水浴中回流1 h，靜置后取上層清液過濾，重復提取3 次，將收集到的濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計算皂苷提取率。

（2）料液比單因素實驗。準備4 個干凈的150 mL和2個500 mL具塞玻璃錐形瓶，準確稱取6份0.2 g（精確到小數點后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。分別用移液槍和量筒準確量取12.5 mL（1∶62.5 g∶mL）、25.0 mL（1 ∶125 g ∶mL）、50.0 mL（1 ∶250 g ∶mL）、100.0 mL（1∶500 g∶mL）、200.0 mL（1∶1 000 g∶mL）和400 mL（1 ∶2 000 g ∶mL）的50%vol 酒精溶液，分別加入6 個錐形瓶中，搖勻。在20 ℃恒溫水浴中回流1 h，靜置后取上層清液過濾，重復提取3 次，將收集到的濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計算皂苷提取率。

（3）提取溫度單因素實驗。準備6 個干凈的150 mL 具塞玻璃錐形瓶，準確稱取6 份0.2 g（精確到小數點后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。分別用量筒量取50 mL 的60%vol 酒精溶液加入錐形瓶，搖勻。分別控制在恒溫水浴溫度為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的條件下回流1 h，靜置后取上清液過濾，重復提取3 次，取收集到的濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計算皂苷提取率。

（4）提取時間單因素實驗。準備6 個干凈的150 mL 具塞玻璃錐形瓶，準確稱取6 份0.2 g（精確到小數點后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。用量筒準確加入50 mL 的60%vol 酒精溶液，分別在恒溫60 ℃水浴的條件下回流1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h，靜置后取上清液過濾，重復提取3 次，取濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計算皂苷提取率。

1.3.3 分光比色法測定總皂苷的含量

（1）對照品溶液的制備。取對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，充分混勻使之溶解，得到對照品溶液，其濃度10 mg/mL。

（2）韭菜籽提取液的制備。將韭菜籽放入破壁機打碎后過篩得到韭菜籽粉末，精密稱量韭菜籽粉末0.200 0 g 置于錐形瓶中。用量筒量取50 mL 一定度數的乙醇溶液加入錐形瓶中進行提取，充分振蕩錐形瓶，提取后過濾出濾液待測。

（3）測定波長的選擇。用合適量程范圍的移液槍分別準確移取1.5 mL 對照品溶液、1 mL 韭菜籽預先粗提取液于干凈磨口錐形瓶中，真空旋轉蒸發溶液至近干的狀態。迅速用移液槍準確向錐形瓶中加入0.8 mL 的高氯酸、0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸（不可用久置試劑，現用現配），使瓶內物質完全溶解，皆置于60 ℃水浴中進行顯色反應15 min，而后用流動水快速冷卻旋蒸瓶。加入5 mL 冰醋酸搖晃均勻，立即（防止冰醋酸揮發產生較大誤差）在400 ～800 nm 波長下掃描紫外分光光度，記錄數據與曲線圖。如圖1、圖2 所示，對照品（即純品）跑出吸光度曲線中的高峰（標記2），與韭菜籽粗提取液跑出吸光度曲線中的高峰（標記2）是在同一波長區域的位置，則能夠確定兩個位置的物質為同一物質——皂苷。由此可以得到分光比色法測定韭菜籽中皂苷的波長為454 nm，為后續測定做準備。

圖1 200 ～1 000 nm 韭菜籽純品中皂苷的吸光度曲線

圖2 200 ～1 000 nm 韭菜籽提取液中皂苷的吸光度曲線

（4）標準曲線繪制。用移液槍分別準確吸取對照品溶液（1 mg/mL）0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL、0.45 mL 和0.55 mL，于干凈的25 mL 圓底燒瓶中。70 ℃真空旋轉蒸發至近干，迅速用移液槍準確加入0.8 mL 的高氯酸，0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸，同時作一空白樣，皆置于60 ℃水浴顯色15 min 后，用流動水迅速冷卻燒瓶。加入5 mL 冰醋酸搖晃均勻，立即在454 nm 下測定吸光度，記錄數據，繪制標準曲線。

（5）樣品皂苷含量測定。用移液槍精密移取2 mL韭菜籽提取液于干凈磨口錐形瓶中，按（4）中步驟測定吸光度，以標準曲線方程計算樣品中皂苷的含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制結果

由1.3.3（4）中測得數據繪制標準曲線如圖3 所示。韭菜籽中皂苷含量的標準曲線方程為y=1.840 5x-0.007 7，R2=0.993 4。

圖3 皂苷標準曲線圖

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 不同酒精濃度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

在整個提取工藝中，提取劑的支出成本占總成本的比重較大，考慮到節約成本是企業獲利的一個重要方面，就要最大限度地發揮提取液的提取效果。傳統工藝中，草本中藥中的提取物多為簡單可取的資源，例如用酒精或者水作為溶劑來提取，選擇合適的酒精提取液濃度也可以合理有效地減少提取的成本。由圖4 可知，當使用50%vol 酒精時，韭菜籽中皂苷的提取效果最佳，因此選取50%vol 的酒精是最為合理的。

圖4 不同酒精濃度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.2.2 不同料液比對韭菜籽中皂苷提取率的影響

料液比越大，則意味著細胞內的液體濃度與細胞外溶劑之間的濃度差越大，活性物質分子的擴散速率也就越快，滲透作用加速。由圖5 可知，料液比從1 ∶62.5 到1 ∶1 000，隨著溶劑體積量的增大，提取率會也隨之遞增。但超過1 ∶1 000 后的提取率出現異常下降，其中原因不得而知，考慮到提取后的濃縮經濟成本及復雜的技術、不確定因素等，并且在料液比在1 ∶125 ～1 ∶250 皂苷提取率趨近于平穩狀態，故選取料液比為1 ∶250。

圖5 不同料液比對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.2.3 不同提取溫度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

由圖6 知，一定范圍內，皂苷的提取率隨著溫度的升高而不斷提升。物質溶解于溶劑中時會吸收溶劑中的熱量，當物質內的溫度升高，根據化學平衡移動原理，反應條件改變，系統內的平衡會向有利于吸熱的方向移動。提取溫度升高到70 ℃后，系統內就會產生一些化學反應變化，導致提取率降低。因此，提取溫度定為60 ℃最為合適。

圖6 不同提取溫度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.2.4 不同提取時間對韭菜籽中皂苷提取率的影響

由圖7 可知，提取時間越長，提取率越高，因此在工業化生產中的提取時間有待進一步比對確定。皂苷的提取率在2 ～4 h 達到一定的穩定狀態，則實驗室中的最佳提取時間可選用3 h 左右。

圖7 不同提取時間對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.3 工藝條件驗證

綜合本次單因素實驗結果，皂苷提取的實驗室最優條件為50%vol 酒精、溫度60 ℃、料液比1 ∶250、提取時間3 h。取6 組該條件下提取出的平行樣品，測得韭菜籽總皂苷含量的均值為4.63%（表1）。

表1 含量測定結果表

3 結論

韭菜籽中有效物質的分離、純化對于韭菜籽藥理作用的研究有十分重要的意義，補腎抗疲勞產品具有很大的市場應用前景。本研究采用單因素實驗法對提取工藝條件進行優化，得到韭菜籽中提取皂苷的最優條件為50%vol 酒精作為溶劑提取液、料液比1 ∶250（體積比）、60 ℃恒定溫度回流、提取時間設定在3 h 左右，提取3 次。由于實驗室設備等的限制，在實際生產中分離、過濾等方面提取條件應該根據具體的設備條件進行適當調整。