Central-Composite Design 響應面實驗設計用于金盞菊提取工藝的研究

時 宇，成永燕，劉芷萱，劉睿姿，孫 政，遲夢辰

（山東第一醫科大學（山東省醫學科學院），齊魯制藥集團有限公司，山東濟南 250000）

金盞菊為來源于菊科盞菊屬植物金盞菊的干燥全草，具有清熱解毒、涼血調經之功效[1-2]。現代藥理學研究表明，金盞菊具有良好的抗炎、抗菌及抗氧化作用，被廣泛用于食品、化妝品及醫療領域。金盞菊中主要包含黃酮類、皂苷類及揮發油等多種化學成分[3]。有效成分作為中藥發揮作用的物質基礎，如何最大限度地提取藥材中的有效成分是充分利用中藥的首要前提。因而，其提取工藝的研究成為中藥制劑研究的重要內容之一。

在提取工藝的優化過程中，需要考察不同因素、不同水平對有效成分提取效率的影響，該過程往往是涉及多因素、多水平、多目標的復雜過程，而目前應用較多的優化方法大多采用單因素實驗設計或正交實驗設計，不能全面、綜合地反映提取工藝的優劣。中心組合設計（Central Composite Design，CCD）作為效響應面實驗設計的一種，通過建立因素與響應值之間的數學擬合方程，能夠結合統計學分析尋求最佳工藝參數。近年來，該方法被廣泛用于藥材的提取工藝及處方設計的優化研究中[4-5]。

本實驗擬采用中心組合設計，以金盞菊中有效成分總黃酮及浸出物為考察指標，對其提取工藝進行優化，以期確定金盞花的最佳提取工藝，為金盞菊開發和利用提供實驗方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平[BT25S，賽多利斯儀器（北京）有限公司]；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；紫外可見光分光度計（UV-8000A，上海元析儀器有限公司）。

金盞菊藥材購于漱玉平民大藥房，經鑒定為菊科植物金盞菊的全草；蘆丁對照品，購于中國食品藥品檢定研究院（批號100080-202012）；無水乙醇、三氯化鋁等所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 金盞菊提取工藝條件CCD 實驗設計

根據中心組合響應面實驗設計的原理，利用Design-Expert?軟件以總黃酮得率及浸膏得率為響應值，以藥材與提取溶劑的比例（料液比）、乙醇濃度、提取溫度為自變量，設計3 因素3 水平的響應面試驗，對金盞菊的提取工藝進行優化。金盞菊提取工藝條件CCD 實驗設計的因素水平見表1。

表1 CCD 實驗設計因素水平表

1.2.2 供試品溶液配制

精密稱取金盞菊藥材粉末5.0 g，按照表2 中實驗設計安排分別加入不同濃度的乙醇溶液，回流提取2 次，濾過后合并兩次濾液定容至250 mL 容量瓶中，作為供試品溶液備用。

1.2.3 浸膏得率的測定

精密量取1.2.2 項下供試品溶液10.0 mL 置于已知質量（M1）的蒸發皿中，水浴加熱蒸干，105 ℃烘箱中干燥4 h 直至恒重（M2），則浸出物的質量為M2-M1。因此，

1.2.4 總黃酮含量的測定

（1）對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品4.04 mg 置于10 mL 容量瓶中，乙醇溶解并稀釋至刻度，制備成濃度為0.404 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。

（2）標準曲線的制備。分別精密量取（1）項中蘆丁對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加入1%三氯化鋁乙醇溶液5.0 mL，乙醇定容至刻度。隨后置于50 ℃水浴中顯色10 min[6]。以乙醇作為空白，在200 ～800 nm波長下進行光譜掃描，確定最大吸收波長為418 nm。在418 nm 波長下測定吸光度，以吸光度值為縱坐標，蘆丁濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線。

（3）供試品溶液的測定。精密量取1.2.2 項下供試品溶液5.0 mL，加入1%三氯化鋁乙醇溶液5.0 mL，50 ℃水浴中顯色10 min。以乙醇作為空白，于418 nm 波長下測定吸光度，根據標準曲線計算總黃酮含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

經紫外分光光度計測定蘆丁的標準曲線回歸方程為A=23.418C+0.017 6(R=0.999 7)。結果表明，蘆丁在8.08 ～40.40 μg/mL 線性關系良好。

2.2 精密度、穩定性及重復性實驗

精密移取蘆丁對照品溶液0.5 mL 于容量瓶中，按1.2.3（2）項下方法進行操作，測定其吸光度值，連續測定6 次，計算RSD 值為0.82%，表明儀器精密度良好。將上述溶液每隔15 min 測定其吸光度考察穩定性，計算RSD 值為1.79%，表明該顯色反應在2 h 內穩定。取同一批次樣品6 份，按上述方法進行重復性實驗，計算RSD 值為1.31%，表明方法重復性良好。

2.3 加樣回收率實驗

取已知黃酮含量的金盞菊粉末6 份，每份0.5 g，精密稱定，加入蘆丁對照品2.5 mg，按照供試品溶液制備方法及顯色方法操作，測定總黃酮含量，計算加樣回收率，結果表明平均回收率為96.5%，RSD為2.35%。

2.4 最佳提取工藝條件的確定

根據Design expert 軟件所安排的實驗，測定每個實驗組的總黃酮含量及浸膏得率，結果見表2。

表2 CCD 實驗設計方案及結果安排表

將所得的實驗結果進行方差分析并擬合數學模型，結果見表3。

表3 響應值模型方程擬合結果

由回歸方程模型的R2值及P值可知，二項式方程模型的擬合度和可信度良好，實驗誤差小。以總黃酮含量為考察指標時，其方程為：Y1=0.672 1+0.038 0X1+0.18 10X2+0.052 0X3+0.010 0X1X2+0.007 5X1X3+0.042 5X2X3-0.026 2X12-0.051 2X22+0.003 8X32（R2=0.882 1）。以浸出物得率為考察指標時，其回歸方程為：Y2=4.52+0.363 0X1+0.181 0X2+0.101 0X3+0.240 0X1X2+0.012 5X1X3-0.087 5X2X3+故可用上述模型方程分析和預測金盞菊的提取工藝。

根據所擬合的二項式方程，繪制各考察因素對總黃酮和浸膏得率的三維效應曲面圖，結果見圖1、圖2。由圖1 可知，隨乙醇濃度的增加，總黃酮含量呈顯著增加趨勢，而料液比及提取時間對其影響不大，曲面上升趨勢較為平緩，這可能與黃酮在高濃度乙醇中溶解度較大有關，同時因為金盞花質地較為疏松，提取溶劑容易滲透到藥材內部，會更快達到動態平衡，故料液比及提取時間對總黃酮的提取影響不大。

圖1 料液比、乙醇濃度及提取時間對金盞菊總黃酮提取率影響的三維效應曲面圖

圖2 料液比、乙醇濃度及提取時間對金盞菊浸膏得率影響的三維效應曲面圖

由圖2 可知，乙醇濃度及料液比對浸膏得率的影響呈現馬鞍狀分布，呈現出先增加后降低的趨勢。

由預先設定的限定條件，即希望總黃酮含量及浸膏得率保持最大浸出量，分析料液比、乙醇濃度及提取時間對金盞菊提取工藝的影響。由Design expert軟件確定金盞菊的最優提取工藝條件為藥材與溶劑的比例為1 ∶12，乙醇濃度為68%，提取時間為1.8 h，共提取兩次。在此條件下，總黃酮含量和浸膏得率的預測值分別為0.86%和5.16%。

2.5 驗證實驗

在最優條件下進行3 次平行實驗以檢驗CCD 實驗設計的可靠性，所得到的金盞菊總黃酮含量和浸膏得率分別為0.83%和5.12%，與預測值接近，說明預測模型具有良好的可靠性。

3 結論

中心組合響應面實驗設計能夠更全面地表征各工藝參數對實驗結果的影響，尤其是適合于多因素連續變量對響應值的影響[7]。在本實驗中，利用CCD響應面實驗設計，將總黃酮含量及浸膏得率作為響應值，將其限定為“最大值”進行優化，通過數學模型擬合獲得最優提取工藝條件，能夠克服正交實驗及均勻實驗設計單一線性模型的不足。實驗結果表明，金盞花最佳提取工藝條件為藥材∶溶劑（1∶12），乙醇濃度68%，提取時間1.8 h，提取兩次，此條件下總黃酮含量和浸膏得率的預測值分別為0.86%和5.16%。該最佳工藝能夠較大程度提高金盞菊中指標成分的提取效率，為其進一步開發利用及產品深加工提供理論基礎及實踐依據。