柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定食品中的亞硝酸鹽

袁 圓，崔曉嬌，周金沙，尹芳平，黃 亮，夏煒杰

（長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所&國(guó)家酒類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南長(zhǎng)沙 410000）

目前，有關(guān)亞硝酸鹽的檢測(cè)方法主要有離子色譜法[3-4]、分光光度法[5-6]、高效液相色譜法、氣相色譜法、熒光法、化學(xué)傳感器法和催化光度法等。現(xiàn)行國(guó)標(biāo)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）采用的是離子色譜法和分光光度法，但離子色譜法受高鹽食品中氯離子干擾較大，分光光度法則受色素的干擾較大。陳文生等[7]采用高效液相色譜法在204 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定亞硝酸根離子，此法前處理較簡(jiǎn)單，但分析的基質(zhì)比較單一，且低波長(zhǎng)下檢測(cè)可能存在干擾。目前，能同時(shí)不受色素、高鹽食品中氯離子影響且不受低波長(zhǎng)干擾的液相色譜法未見(jiàn)報(bào)道。本研究參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016），利用亞硝酸根離子與對(duì)氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺衍生顯色生成紫紅色的偶氮化合物（目標(biāo)物）進(jìn)行柱前衍生，采用C18色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離，在高波長(zhǎng)（480 nm）下進(jìn)行檢測(cè)，可為含高鹽和色素等復(fù)雜基質(zhì)中亞硝酸鹽含量的測(cè)定提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒、威士忌、液體奶、腌肉和醬腌菜為市售樣品；陽(yáng)性白酒、威士忌、液體奶均為實(shí)驗(yàn)室自制。

肉制品中亞硝酸鹽質(zhì)控樣品（批號(hào)為CFAPAQC202107B-2，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司）；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（200.0 mg/L）、檸檬黃（純度96.2%）、新紅（純度88.9%）、莧菜紅（純度95.3%）、胭脂紅（純度89.8%）、日落黃（純度93.7%）、 亮 藍(lán)（ 純 度87.6%）、 赤 蘚 紅（ 純度86.0%）、誘惑紅（純度97.9%）和酸性紅（純度93.2%），均為北京曼哈格生物科技有限公司；乙酸銨、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅硼砂、對(duì)氨基苯磺酸和亞鐵氰化鉀，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，德國(guó)默克公司；實(shí)驗(yàn)用水，法國(guó)Millipore 公司純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫有限公司）；UV-2450 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；EOFO型數(shù)顯型多管式旋渦混合器（美國(guó)Talboys 公司）；Milli-Q Direct8 超純水儀（美國(guó)密理博公司）；超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

吸取2.50 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，配制成5.0 mg/L 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，吸取適量標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別置于50 mL 帶塞比色管中，分別加入2 mL 的4 g/L 對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min 后各加入1 mL 2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min 配成質(zhì)量濃度為0.015 ～0.250 mg/L 的系列工作溶液。

1.3.2 樣品處理

稱(chēng)取威士忌、白酒10 g（精確到0.000 1 g）于50 mL 比色管中，加入30 mL 水，混勻備用；液體奶稱(chēng)取10 g，醬腌菜和腌肉稱(chēng)取2 g（精確到0.000 1 g）于150 mL 錐形瓶中，加入80 mL 水，超聲提取30 min。在75 ℃水浴中加熱5 min，取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，分別加入2.5 mL 106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液、2.5 mL 的220 g/L 乙酸鋅溶液，加水定容至刻度后搖勻，過(guò)濾，棄掉初濾液，取40 mL 濾液于50 mL 比色管中，分別加入2 mL 的4 g/L 對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻備用；各備用液中分別加入2 mL 的4 g/L 對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min 后各加入1 mL 的2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，0.2 μm 親水PTFE微孔濾膜過(guò)濾，待高效液相色譜分析測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨（35 ∶65，V∶V）；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：480 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAD 波長(zhǎng)的選擇

為選取檢測(cè)的最佳波長(zhǎng)，用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，如圖1 所示，目標(biāo)物的最大吸收波長(zhǎng)為480 nm，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm。

圖1 目標(biāo)物的光譜圖

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

（1）色素干擾。由于色素的紫外吸收波長(zhǎng)與亞硝酸鹽顯色后的目標(biāo)物類(lèi)似，在紫外分光光度法中對(duì)亞硝酸鹽的測(cè)定有干擾。因此，為了消除色素在液相色譜法中產(chǎn)生的干擾，優(yōu)化色譜條件時(shí)需要將色素一起優(yōu)化，9 種食品中常見(jiàn)色素分別為檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅、誘惑紅和酸性紅。

（2）流動(dòng)相體系。分別用甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-0.01 mol/L 乙酸銨和甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨4 種體系的流動(dòng)相分析測(cè)定目標(biāo)物與9 種色素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨流動(dòng)相體系下目標(biāo)物與9 種色素的分離效果最好，因此甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨體系被選為流動(dòng)相。調(diào)節(jié)甲醇的比例，當(dāng)甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨的體積比為35 ∶65 時(shí)，目標(biāo)物與9 種色素可以有效分離，且響應(yīng)最好，因此確定甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨體積比為35 ∶65。

（3）不同pH 的乙酸銨溶液對(duì)出峰的影響。用冰乙酸調(diào)節(jié)乙酸銨溶液pH 為3、5 和7 作對(duì)比，由圖2 可知，pH=7 時(shí)，目標(biāo)物與9 種色素分離效果最佳，保留時(shí)間最為適宜，因此選擇pH=7 的0.02 mol/L 乙酸銨作為流動(dòng)相。

圖2 不同pH 乙酸銨溶液中目標(biāo)物的色譜圖

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

考查了與NO2-可能共存的9 種陰離子分別為和F-和與顯色后的目標(biāo)物紫外吸收類(lèi)似的9 種色素（檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅、誘惑紅和酸性紅）對(duì)本研究的干擾，由于9 種陰離子不能參與衍生反應(yīng)，因此對(duì)目標(biāo)物的分析不產(chǎn)生干擾，9 種色素的干擾實(shí)驗(yàn)中，亮藍(lán)、次蘚紅和酸性紅不出峰，誘惑紅、日落黃和胭脂紅能與目標(biāo)物完全分離，因此9 種色素對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)和分離完全無(wú)影響，此方法選擇性較好，適用于分析實(shí)際樣品中的亞硝酸鹽含量。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

分別配制質(zhì)量濃度為0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.060 mg/L、0.100 mg/L、0.150 mg/L 和0.250 mg/L的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在波長(zhǎng)480 nm 下進(jìn)行高效液相色譜分析，以質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得出線性回歸方程為Y=968.87X+0.11，r2=0.999 9，在0.015 ～0.250 mg/L，目標(biāo)物的質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以信噪比（S/N≥3）計(jì)算方法得出檢出限，以信噪比（S/N≥10）計(jì)算方法得出定量限，威士忌、白酒、液體奶、醬腌菜和腌肉的檢出限分別為0.023 mg/kg、0.023 mg/kg、0.057 mg/kg、0.28 mg/kg 和0.28 mg/kg，定量限分別為0.075 mg/kg、0.075 mg/kg、0.19 mg/kg、0.94 mg/kg 和0.94 mg/kg，結(jié)果滿足檢測(cè)的要求。

2.5 精密度及回收率

在本方法條件下，采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，分別進(jìn)行高、中、低3 個(gè)水平濃度加標(biāo)，進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。每4 h 進(jìn)高效液相色譜測(cè)定一次，計(jì)算方法的日內(nèi)精密度，以RSD 表示；每24 h 進(jìn)高效液相色譜測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算方法的日間精密度，以RSD表示。由表1 可知，回收率范圍為83.3%～96.0%（n=6），精密度范圍為1.1%～5.3%；日內(nèi)精密度范圍為1.0%～3.8%（n=6）；日間精密度范圍為2.3%～7.8%（n=3），表明本方法可靠，符合檢測(cè)要求。

表1 方法的平均回收率和精密度

2.6 分光光度法與柱前衍生-高效液相色譜法的比對(duì)

采用GB 5009.33—2016 中的第二法分光光度法和本方法建立的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定肉制品中亞硝酸鹽質(zhì)控樣品、醬腌菜、腌肉和自制陽(yáng)性威士忌、白酒、液體奶中亞硝酸鹽含量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，兩種方法測(cè)定質(zhì)控樣的結(jié)果（取3 次測(cè)定平均值）見(jiàn)表2。由表2 可知，肉制品中亞硝酸鹽質(zhì)控樣品亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的指定值為1.89 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差為0.34 mg/kg，兩種方法|z|值均小于2，結(jié)果均為滿意。兩種方法測(cè)得其他樣品中亞硝酸鹽含量結(jié)果RSD 在5%以?xún)?nèi)，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明高效液相色譜法測(cè)定亞硝酸鹽含量準(zhǔn)確可靠。

表2 兩種方法測(cè)定質(zhì)控樣中亞硝酸鹽結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究建立了柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的方法。測(cè)定實(shí)際樣品和質(zhì)控樣品中亞硝酸鹽含量的結(jié)果比對(duì)，驗(yàn)證了該方法的適用性與準(zhǔn)確性。該方法能夠有效消除氯離子等其他陰離子和色素對(duì)檢測(cè)的干擾，建立的分析方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和回收率好，適用于食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)。