菜田種養結合模式下施肥方式對土壤編碼堿性磷酸酶基因微生物群落的影響*

何 宇,呂衛光, 鄭憲清, 張翰林, 李雙喜, 張娟琴, 張海韻，白娜玲**

菜田種養結合模式下施肥方式對土壤編碼堿性磷酸酶基因微生物群落的影響*

何 宇1,2,呂衛光1,3,4,5, 鄭憲清1,3,4,5, 張翰林1,3,4, 李雙喜1,3,4,5, 張娟琴1,3, 張海韻1,4，白娜玲1,3,4,5**

（1.上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403；2.上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306；3.農業農村部上海農業環境與耕地保育科學觀測試驗站，上海 201403；4.上海市農業環境保護監測站，上海 201403；5.上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403）

為明確菜田種養結合模式下施肥方式對土壤編碼堿性磷酸酶基因的微生物群落結構和多樣性的影響機制，通過Illumina MiSeq高通量測序手段，系統分析了4種不同施肥方式，即不施肥（CK）、施常規化肥（CF）、施有機肥（OF）、有機無機肥混施（MF）對花菜收獲時0?20cm土層土壤理化性質、堿性磷酸酶（ALP）、微生物量磷（MBP）以及微生物群落的影響。結果表明：（1）與CK相比，OF處理可顯著提高土壤有機質、總氮、速效磷和Ca含量47.83%、38.46%、104.81%和69.21%（P<0.05）；OF和MF處理均顯著提高ALP活性；CF和OF分別顯著增加MBP含量56.12%和195.16%，OF處理中MBP含量最高（105.40mg·kg?1）；（2）菜田種養結合模式不同施肥處理中假單胞菌屬（）為優勢屬，CF和MF較CK顯著降低了假單胞菌屬相對豐度33.39%和45.52%；施肥降低土壤微生物Chao1指數，MF提高其多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven）；（3）影響微生物群落結構的關鍵環境因子為MBP、AP、ALP；微生物α多樣性指數與土壤性狀指標無顯著相關性。因此，菜田種養結合模式下，不同施肥處理改變了土壤理化和生物性質，從而驅動了土壤微生物群落組成、結構和多樣性變化。

菜田種養結合；施肥方式；堿性磷酸酶；基因；高通量測序

傳統農業單一種植與養殖分離的生產方式，導致原本互補的種植業、養殖業成為面源污染的首要來源，且降低了農業綜合經濟效益[1]。大量研究表明，立體生態種養能夠發揮生物群體組合的共同功能，實現物種層次、能量循環、物質轉化和技術等要素的優化，是提高農業收入和改善生態環境的有效途徑，如稻-漁種養、稻-鴨種養、漁-菜共生等模式[2?4]。例如，將曝氣生物濾池與蔬菜栽培相結合的密閉循環水產養殖系統，蔬菜和羅非魚均生長良好，且保證了95%以上水資源持續再生[5]。結合生物浮床技術的水培蔬菜和水產動物共生為經典的蔬菜種養結合模式，但該模式限制了蔬菜種植種類和生長需求；而水旱共作的菜田種養模式防旱防澇，擴大了作物和水產動物選擇范圍，還有利于改善系統內產地環境[6]，同時，仿野生養殖的水產動物產品質量好、多訂單貿易[2,7]。

磷是植物必需的常量養分之一，更是農田生態系統中至關重要的營養元素，但中國農業生產中磷當季利用率僅為5%～25%[8]。土壤有機磷占磷素總量的30%～80%，但不能直接被植物利用，需先在磷酸酶作用下轉化為無機磷才可用于植物生長代謝。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）是土壤有機磷水解為可供植物利用的無機磷的關鍵酶，其基因家族主要包括、、等。在陸地生態系統中出現頻率最高，可作為關鍵生物指示物用于研究土壤有機磷的轉化[9]。低磷條件下，誘導基因上調，增加磷酸鹽吸收及轉運的酶，共同構成磷脅迫調節子，從而加速土壤有機磷的轉化過程；而在磷充足的條件下，基因表達受到抑制，ALP活性降低，有利于有機磷的穩定積累[10]。Luo等[9]發現，長期有機無機肥混施和無機肥單施分別顯著增加和降低了土壤中微生物豐度。長期施化肥處理中速效磷（Available phosphorous, AP）含量提高，磷素充足，使得細菌群落豐度和多樣性指數均顯著降低[11]。但王靜等[12]指出，有機肥和有機無機配施處理中的土壤細菌、真菌、功能微生物的豐度和ALP活性都顯著高于不施肥對照和無機肥處理。環境因子如氣候、水分、土壤類型、pH、土地利用方式、農藝措施和養分濃度均可影響ALP活性和微生物的豐度、多樣性和群落結構[13]。

由于環境因子的變化，施肥方式對土壤微生物的影響尚不明確，目前關于草原或常規農田的研究較多，但對水旱共作菜田種養結合系統的研究還鮮有報道。因此，本研究依托上海市農業科學院菜田種養結合（花菜-芋艿輪作）定位試驗站，以花菜季為研究對象，探究不同施肥方式（不施肥、施常規化肥、施有機肥和有機無機混施）對土壤理化性質、ALP及微生物等指標的影響，用于評價不同施肥方式的培肥與增產效果，揭示磷轉化過程中的重要功能菌類群，以期為菜田種養結合模式構建科學合理的施肥制度提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗在上海市農業科學院莊行綜合試驗站（30°53'N, 121°23'E）菜田種養結合試驗小區開展，站內年平均氣溫為15.8℃，年平均降水量為1178.0mm。土質為黏壤土，作物種植模式為花菜（品種為“臺松”）-芋艿（品種為“崇明香酥芋”）輪作，已種植3a。試驗地區土壤2015年初始理化指標為，pH7.48，有機質（SOM）20.08g·kg?1，總氮（TN）1.85g·kg?1，總磷（TP）2.64g·kg?1，速效氮（AN）77.44mg·kg?1，速效磷（AP）35.90mg·kg?1。

1.2 試驗設計

花菜種植和收獲時間分別為2018年9月28日和2019年4月2日。試驗設置4處理，即不施肥（CK）；施常規化肥（CF）；施有機肥（OF）；有機無機混施（MF）。小區為完全隨機區組設計，每個處理3個重復。單個小區包括環形溝和種植區，種植區面積24.00m2，水域面積13.44m2（圖1）。投放水生動物種類為黃鱔+泥鰍+鯽魚，其投放量為黃鱔75kg·hm?2，泥鰍15萬尾·hm?2，鯽魚75kg·hm?2。水產動物以誘集燈捕獲飛蟲及水中營養為食物，不額外投加餌料。作物收獲后將地上部秸稈及根茬移除，水產動物也一并捕撈收集，農田管理措施與當地高產田一致。

施肥處理為等氮磷鉀處理，施用的N、P（P2O5）和K（K2O）肥分別約為402、118和285kg·hm?2。施肥主要分為基肥、蓮座肥、花球初期肥、花球中期肥等。OF中有機肥全部用作基肥，折算為每個小區施用有機肥48.22kg。MF處理中施入約25%有機肥作為基肥，其余部分用無機肥補足。具體肥料用量見表1。

1.3 項目觀測

1.3.1 土壤生物性質和理化性質的觀測

花菜收獲后，各小區種植區選取若干分布均勻且具代表性的采樣點，依據“S”形五點采樣法用直徑4cm不銹鋼采土器采集0-20cm土壤樣品，并去除土壤表層枯葉、石子及根系。將同小區樣品均勻混合后裝入聚乙烯封口袋中，做好標記。土樣經過自然風干后研磨過0.25mm土壤篩，用于測定土壤酶活性。ALP活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，加入硼酸鹽緩沖液，37℃下培養，以每克土每24h酶促反應產生的酚的mg數表示。微生物量磷（MBP）指土壤中所有活體微生物中所含有的磷，主要成分是核酸、磷脂等易礦化有機磷及部分無機磷，是有效養分的儲備庫，測定方法參考文獻[14]中的滅菌-NaHCO3法。土壤SOM測定采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法，土壤pH采用電位法（水:土=2.5:1）測定，TN含量采用凱氏定氮法-自動定氮儀測定，TP（以P2O5計）采用酸溶-鉬銻抗比色法測定，AP采用0.5M NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定[15]。

圖1 菜田種養結合模式小區示意圖

表1 試驗處理及肥料用量（kg·hm?2）

注：有機肥2-0.6-1.5；復合肥15-15-15；尿素中含氮量46%；過磷酸鈣中含磷量16%；硫酸鉀中含鉀量50%。CK：不施肥；CF：施常規化肥；OF：施有機肥；MF：有機無機混施。下同。

Note: Organic fertilizer: 2-0.6-1.5; compound fertilizer: 15-15-15; urea contains 46% nitrogen; superphosphate (SP) contains 16% phosphorus; potassium sulfate (PS) contains 50% potassium. In the treatments, CK: no fertilization; CF: conventional chemical fertilizer; OF: organic fertilizer; MF: organic-inorganic mixed fertilizer. The same as below.

1.3.2 土壤樣品DNA提取及高通量測序

將花菜收獲季所取土樣除去雜質，分成兩部分，一部分用于測定土壤酶活性和理化性質，另一部分存于-80℃用于土壤DNA提取。按照MiBio PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒手冊的操作步驟提取土壤微生物總DNA，并使用超微量分光度計檢測總DNA濃度和質量。利用引物序列ALPS-F730（5'-CAGTGGGACGACCACGAGGT-3'）和ALPS-1101（5'-GAGGCCGATCGGCATGTCG-3'）擴增基因，片段長度約371bp。PCR擴增反應體系為PCR Mix 12.5μL，上下游引物（10mM）各1μL，DNA模板1μL，H2O補足至25μL。反應參數為94℃預變性3min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環，72℃延伸10min。高通量測序送由上海某公司采用Illumina MiSeq平臺完成。

數據分析主要包括原始數據處理、操作分類單元（OTU）篩分與歸類、α多樣性、環境因子關聯分析等。經質控及數據處理后得到可用于后續分析的高質量序列（Clean Data），按照相似度97%以上進行OTU聚類，以豐度最大的序列為代表序列。比對數據庫為美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）本地核酸序列數據庫（Nucleotide Sequence Database，NT）。

1.4 數據處理

數據的整理與統計分析用Excel 2020和SPSS 16.0的one-way ANOVA法，采用ORIGIN 2019和R語言繪制柱形圖、扇形圖、韋恩圖（Venn）、基于距離的冗余分析（distance-based Redundancy Analysis，db-RDA）等。

2 結果與分析

2.1 種養結合模式下施肥方式對土壤微生態環境的影響

由表2可見，不同施肥方式對菜田種養結合模式的土壤理化性質有一定影響。菜田種養結合模式下，各處理花菜土壤均呈弱堿性，pH在7.96～8.69，處理間差異不顯著，說明土壤酸堿性未受到施肥方式的影響。施肥方式對土壤總磷（TP）含量也無顯著影響。施肥方式對土壤中SOM含量有一定影響，其中有機肥（OF）處理中SOM含量最高（2.72%），顯著高于其它處理（P<0.05），其它三個處理間差異不顯著。從數值看，有機無機混施（MF）處理中SOM含量次高（2.09%），常規化肥（CF）處理有機質含量最低（1.62%），說明有機肥施入會使SOM含量提高，而化肥則降低SOM含量。土壤TN含量與SOM類似，在OF和MF處理中含量較高，相較于CK增幅為30.77%～38.46%，在CK和CF處理中含量較低。有機肥的施加提高了土壤速效磷（AP）和鈣（Ca）含量，OF處理最顯著（P<0.05），與對照CK相比分別提高了104.81%和69.21%；MF處理次之，增幅為51.53%和36.64%。

不同施肥方式對菜田種養結合模式土壤生物性質的影響不同（圖2）。菜田種養結合模式下，OF和MF處理均顯著提高了土壤ALP酶活（P<0.05），分別為14.60μg·min?1·g?1和12.06μg·min?1·g?1，二者無顯著差異，可見有機肥施用有利于提高土壤堿性磷酸酶活性。土壤微生物量是土壤有機磷最為活躍的部分，是植物磷素營養非常重要的來源。施肥方式同樣顯著影響了土壤微生物量磷（MBP），與CK相比，常規施肥（CF）和有機肥（OF）處理顯著提高了MBP含量（P<0.05），且OF處理中MBP含量最高（105.40mg·kg?1）；但MF處理中MBP含量與CK處理無顯著差異。

表2 花菜收獲時不同施肥處理的土壤理化性質比較

注：SOM：土壤有機質；TN：總氮；TP：總磷；AP：速效磷；Ca：鈣。表中數據為平均值±標準誤，小寫字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性。下同。

Note: SOM: soil organic matter; TN: total nitrogen; TP: total phosphorus; AP: available phosphorus; Ca: calcium. The bar is the mean data ± SD; lowercase indicates significant difference among treatments at 0.05 level. The same as below.

圖2 菜田種養結合模式不同施肥處理下土壤堿性磷酸酶和微生物量磷比較

2.2 菜田種養結合模式下施肥方式對土壤phoD微生物群落組成及多樣性的影響

2.2.1微生物群落物種組成分析

由圖3a和表3可知，種養結合模式下不同施肥處理改變了微生物群落結構，但未顯著影響其群落組成。對相對豐度超過1%的門水平物種分析發現，土壤中優勢菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），占總細菌群落數的97.56%以上。其中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度為67.90%～85.56%，放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度為9.35%～28.61%，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度范圍為1.89%～5.45%。此外，酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和藍細菌門（Cyanobacteria）的相對豐度也較高。相比于CK，OF處理顯著提高了變形菌門（Proteobacteria）相對豐度，增幅為13.13%，而CF和MF與對照無顯著差異。CF相較于CK顯著提高了放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度，增幅為64.61%。CF和MF較CK處理顯著降低了芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）相對豐度96.51%和59.27%。對于浮霉菌門（Planctomycetes）而言，CF與OF處理間表現出顯著差異（P<0.05）。不同處理間的酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和藍細菌門（Cyanobacteria）相對豐度差異并不顯著。

圖3 花菜收獲時不同施肥處理下phoD微生物門（a）、屬（b）水平群落相對豐度

表3 花菜收獲時不同施肥處理土壤phoD微生物門水平相對豐度（%）比較

由圖3b和表4可知，菜田種養結合模式不同施肥處理下屬水平相對豐度前10的微生物依次為假單胞菌（）、貪銅菌屬（）、鏈霉菌屬（）、慢生根瘤菌屬（）、多形單胞菌屬（）、溶桿菌屬（）、芽單胞菌屬（）、山崗單胞菌屬（）、游動放線菌屬（）和變異桿菌屬（）。上述菌屬主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。假單胞菌屬（）為優勢屬，豐度范圍為20.30%～37.26%。在菜田種養結合模式下，不同施肥方式顯著影響了假單胞菌屬（）、鏈霉菌屬（）、多形單胞菌屬（）、芽單胞菌屬（）、山崗單胞菌屬（）的相對豐度（P<0.05）。與CK相比，CF和MF處理顯著降低了假單胞菌屬（）的相對豐度，降幅為33.39%和45.52%，芽單胞菌屬（）相對豐度降幅為64.14%和59.27%。對于有機肥施用而言，OF和MF顯著提高了多形單胞菌屬（）的相對豐度132.08%和83.02%；并顯著降低了山崗單胞菌屬（）的相對豐度，范圍為14.97%～70.05%。其他屬水平微生物各處理間差異不顯著。

表4 花菜收獲時不同施肥處理下土壤phoD相對豐度（%）前10屬水平物種比較

2.2.2 對微生物群落α多樣性的影響分析

Venn圖分析表明（圖4a），4個處理中共有的OTUs數目為617個，占總OTUs數目的8.14%。CK、CF、OF、MF處理中獨有的OTUs數分別為1748、1156、791和935，分別占總OTUs數目的23.06%、15.25%、10.43%和12.33%。CK、CF、OF、MF處理中所包含的總OTUs數分別為4068、2960、2717和2762。各處理所包含的OTUs數及獨有OTUs數均以CK最多，OF和MF最少。表明施肥減少了土壤微生物類群。共有的OTUs中，有15個OTUs數超過1%，主要分布在變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）（圖4b）。

表5表明，菜田種養結合模式下，施肥方式顯著影響了土壤微生物豐富度（Chao1）、多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven）（P<0.05）。不管是施加無機肥還是有機肥均顯著降低了微生物的Chao1值，范圍為33.40%～35.80%。Simpson指數值越大，群落多樣性越低，MF處理中土壤樣本多樣性高于OF處理（P<0.05），但與CK相比，均無明顯差異。Simpsoneven指數為均勻度指標，施肥處理（CF、OF、MF）提高了土壤微生物均勻度，其中MF處理最高，為0.05。而對于Shannon值，各處理間無顯著差異。因此，在菜田種養結合模式下，肥料施用降低土壤微生物豐富度，且MF能夠增加微生物的多樣性和均勻度。

圖4 菜田種養結合模式下不同施肥處理土壤中phoD微生物Venn圖(a)及共有OTUs分析(b)

表5 花菜收獲時不同施肥處理對土壤phoD微生物α多樣性的影響

2.3 菜田種養結合模式下土壤phoD微生物群落結構與環境因子關聯性分析

為避免較強多重共線性環境因子的影響，通過方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）分析，篩選去除VIF值>10的無用環境因子，篩選后的7個環境因子指標用于進行基于unweighted-unifrac距離的冗余分析（db-RDA）。由圖5可見，不同施肥處理對土壤微生物群落結構有顯著影響，各環境因子均與CAP1軸正相關。CAP1和CAP2軸分別解釋了微生物群落組成變化的12.35%和9.91%，其中CAP1較好地將施加化肥處理（施常規化肥CF和有機無機混施MF）與未施加化肥處理（對照CK和施有機肥OF）區分開來，但有無有機肥施加處理間的區分度不明顯。從整體看來，環境因子對CF和MF處理影響更大。同時，影響微生物群落結構的關鍵環境因子為微生物量磷（MBP）（P=0.006）和速效磷（AP）（P=0.028），而堿性磷酸酶（ALP）次之，其P值為0.091。如表6所示，相關性分析表明，菜田種養結合條件下，花菜收獲季土壤中ALP活性與除pH外的土壤理化性狀（SOM、TN、TP、AP和Ca）和MBP呈顯著正相關；但微生物α多樣性指數與土壤性狀無顯著相關性。Ca作為基因合成的ALP酶活性的輔酶因子，可間接影響群落組成[9]，Ca與磷相關指標（TP、AP、MBP、ALP）呈顯著正相關，但與微生物α多樣性指數無明顯相關關系。

圖5 菜田種養結合模式下不同施肥處理phoD微生物群落結構與環境因子的db-RDA關聯分析

表6 土壤性狀與phoD微生物群落α多樣性的Pearson相關分析

注：*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。MBP：微生物量磷，ALP：堿性磷酸酶。

Note:*is P<0.05;**is P<0.01. MBP: microbial biomass phosphorus; ALP: alkaline phosphatase.

3 結論與討論

3.1 討論

3.1.1 菜田種養結合模式下不同施肥處理對土壤理化和生物性狀的影響

本試驗結果表明，菜田種養結合模式下，施有機肥處理（OF）顯著增加了土壤有機質（SOM）、總氮（TN）、速效磷（AP）和鈣（Ca）含量（P<0.05），有機無機混施（MF）中養分含量增幅次之，這與前人研究結果一致[12]。施常規化肥處理（CF）則降低了土壤SOM含量，蔣太明等[16]在黃壤土中也發現了同樣趨勢。鄔奇峰等[17]以杭嘉湖平原典型稻麥輪作區長期定位施肥試驗土壤為對象，發現所有施肥處理均降低土壤pH、提高SOM和TN/TP/TK含量，且秸稈與化肥配施、有機肥、有機無機混施等處理效果更顯著。該結果的不同可能是由于作物種類、土壤質地、土地利用方式等原因的影響。本次試驗也同樣觀察到，OF處理組養分釋放慢，導致花菜產量低，MF的花菜產量是OF的4.56倍。化學肥料可及時為作物提供所需速效養分；有機肥不僅為土壤微生物提供碳源，還間接提高養分累積的供應能力；有機無機配施則在避免單施有機肥養分釋放慢、速效養分含量不足的同時，也避免了化肥引起的土壤有機質水平偏低的問題[18]。

土壤酶活性受施肥等因素影響較大，磷酸酶活性高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉化及其生物有效性[19]。本試驗中，CF處理中速效養分無機磷的釋放抑制了ALP活性（8.46μg·min?1·g?1），而有機磷肥料的施用（OF和MF處理）則促進了ALP活性（12.06～14.60μg·min?1·g?1），可見有機肥添加有利于提高土壤酶活性，從而有利于養分循環與周轉，與前人報道一致[11,20]。有機肥施用主要增加土壤有機磷，有機磷需在微生物參與下逐步礦化為植物可直接利用的磷[21]，因此，ALP活性在OF和MF處理中顯著提高。花菜收獲時，OF處理中土壤MBP值最高，可能原因在于有機肥養分釋放緩慢，此時磷素充足，含磷微生物可在生物量中儲存磷素[22]。在土壤可利用磷含量較低時，微生物為了獲得更多磷素，加速其編碼蛋白的功能[23?25]，即堿性磷酸酶（ALP）活性增加。但在本研究中，ALP活性與土壤性狀（SOM、TN、TP、AP、MBP和Ca）呈顯著正相關，且MBP含量與SOM、AP、ALP和Ca呈顯著正相關。已有研究報道ALP與土壤pH、TN、SOM等指標呈正相關，與總磷（TP）和生物可利用的速效磷（AP）呈負相關[9]，本試驗中結果不一致的主要原因可能是與菜田種養結合模式的水旱微環境、土壤微生物群落的數量及活性有關[6,14]。因此，后續研究應注重花菜不同生長時期的節點分析，進一步闡明土壤中ALP和MBP的動態變化規律。

3.1.2 菜田種養結合模式下不同施肥處理對土壤微生物群落及多樣性的影響

微生物群落對磷肥投入的反應在不同環境地點和試驗條件下有所不同。本試驗表明，變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是優勢菌門，所占豐度為93.01%～96.85%，這與前人的研究結果一致[26]，但廖梓鵬[13]對珠三角農田土壤微生物分析發現，優勢門為未培養細菌（uncultured_Bacteria），其次為變形菌門（Proteobacteria），這可能與土壤類型及種植模式不同有關。假單胞菌（）為不同施肥處理的優勢屬，相對豐度最高（20.30%～37.26%）。而在常規草地或耕地中的優勢微生物主要為鞘氨醇單胞菌（）、芽孢桿菌（）、甲基桿菌（）和慢生根瘤菌（）等[21,27]，可見菜田種養結合模式下的微生物群落組成有別于其他農田或種植模式。豐度前10物種中有顯著差異的屬為假單胞菌（）、鏈霉菌（）、多形單胞菌（）、芽單胞菌（）和山崗單胞菌（）。假單胞菌（）在對照處理（CK）中含量最高，可能在貧磷條件下的有機磷礦化中發揮重要作用[11]。鏈霉菌（）為環境中常見的生防益生菌，能夠產生次生代謝產物，促進植物生長[28]；其在本試驗中的豐度變化推測可能與花菜的長勢情況有關。多形單胞菌（）為固氮菌，在OF和MF處理中豐度的增加，推測該種微生物可能將磷礦化與氮固定相耦合[29]。而與氮素循環相關的芽單胞菌（）和以真菌菌絲體為食的山崗單胞菌（）的相對豐度均由于肥料施用呈現一定程度的降低，具體原因尚不明確[30]。此外，豐度較低且與氮、磷元素循環相關的慢生根瘤菌、中華根瘤菌、黃桿菌和節桿菌[9,31?32]，也受到了施肥的影響。因此，考慮到種養結合模式能夠顯著提高肥料養分利用效率[7]，該系統下的固氮、解磷相關功能菌在土壤氮循環和磷周轉間的耦合關系需加強研究。

本試驗結果表明，在菜田種養結合模式下，肥料施用降低了土壤微生物豐富度（Chao1），但MF增加了微生物的多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven），說明有機無機混施有利于重塑微生物結構。基于unweighted-unifrac距離的冗余分析（db-RDA）表明，微生物群落結構與pH、AP、ALP、Ca、TN、TP、MBP存在相關性，表明這些土壤理化和生物性質在編碼堿性磷酸酶基因的微生物群落變化中發揮重要作用。其中MBP、AP、ALP的作用要強于其他土壤指標，它們都是影響含土壤編碼堿性磷酸酶基因的細菌群落結構的主要因素[11]，涉及有機磷與無機磷之間轉運、礦化和同化等過程。磷細菌對磷肥的不同反應表現可能是由于磷肥的不同形式、土壤類型和試驗條件造成的[33]。Pearson相關分析表明，微生物的α多樣性與任何環境因素均無顯著相關性，說明其對施肥方式的變化響應不敏感，與Liu等的研究結果一致[33]。綜上所述，菜田種養結合模式下，不同施肥處理改變了土壤理化和生物性質，從而驅動了土壤微生物群落組成、結構和多樣性變化，有助于為種養結合模式合理施肥提供科學依據。

3.2 結論

（1）菜田種養結合模式下，不同施肥處理影響了土壤理化性質。其中施有機肥處理（OF）顯著提高了土壤有機質（SOM）、總氮（TN）、土壤速效磷（AP）和鈣（Ca）含量，增幅分別為47.83%、38.46%、104.81%和69.21%（P<0.05）。有機無機混施處理（MF）則分別提高了SOM、TN、AP和Ca含量13.59%、30.77%、51.53%和36.64%。與對照處理（CK）相比，OF和MF均顯著提高了土壤堿性磷酸酶（ALP）活性67.05%和37.99%（P<0.05），二者無顯著差異。土壤微生物量磷（MBP）表現為CF和OF較CK分別顯著增加了56.12%和195.16%，且OF處理中MBP含量最高（105.40mg·kg?1）。

（2）菜田種養結合模式下，土壤微生物優勢菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），占總群落數的97.56%以上。相比于CK，OF處理顯著提高了變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度13.13%；CF顯著提高了放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度64.61%；CF和MF顯著降低了芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）相對豐度96.51%和59.27%。假單胞菌屬（）為優勢屬，CF和MF處理較CK顯著降低了假單胞菌屬的相對豐度33.39%和45.52%。肥料施用降低土壤微生物豐富度（Chao1），MF增加了微生物的多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven）。

（3）菜田種養結合模式下，施肥方式影響微生物群落結構，影響微生物群落結構的關鍵環境因子為MBP、AP、ALP。微生物α多樣性指數與土壤性狀無顯著相關性；ALP與土壤SOM、TN、TP、AP、MBP和Ca等含量顯著正相關。

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Effects of Fertilization Regimes on Soil Alkaline Phosphatase Gene Encoding Microbial Community under the Integrated Planting and Breeding System in the Vegetable Field

HE Yu1,2, LV Wei-guang1,3,4,5, ZHENG Xian-qing1,3,4,5, ZHANG Han-lin1,3,4, LI Shuang-xi1,3,4,5,ZHANG Juan-qin1,3, ZHANG Hai-yun1,4, BAI Na-ling1,3,4,5

(1. Eco-environmental Protection Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403; 2. Faculty of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Shanghai Agri-environmental and Cultivated Land Conservation of Scientific Observation and Experiment Station, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai 201403; 4. Shanghai Agri-environmental Protection Monitoring station, Shanghai 201403; 5. Shanghai Key Laboratory of Protected Horticulture Technology, Shanghai 201403)

A field experiment was systematically conducted, using Illumina MiSeq high-throughput sequencing, to analyze the impact of four different fertilizer application regimes (CK, no fertilization; CF, conventional chemical fertilizer; OF, organic fertilizer; MF, organic-inorganic mixed fertilizer) on the soil physicochemical properties, alkaline phosphatase (ALP), microbial biomass phosphorus (MBP), and(gene encoding alkaline phosphatase) microbial community in 0-20cm soil layer at cauliflower harvest season, thus identifying the underlying mechanism of effects of different fertilization regimes on the structure and diversity ofmicrobe under integrated planting and breeding system in vegetable field. The results showed that: (1) compared to CK, OF significantly increased the contents of soil organic matter, total nitrogen, available phosphorus and Ca by 47.83%, 38.46%, 104.81% and 69.21%, respectively (P<0.05); both OF and MF significantly increased ALP activity. The MBP content in CF and OF was improved by 56.12% and 195.16%, respectively, compared with CK; the MBP content in OF was the highest (105.40mg·kg?1). (2)was the dominant genus under different fertilization treatments. CF and MF significantly reduced the relative abundance ofby 33.39% and 45.52%, respectively, compared with CK. Fertilization decreased the Chao1 index, and MF increased both the diversity (Simpson index) and evenness (Simpsoneven index) of soilmicroorganisms. (3) MBP, AP, and ALP were the key environmental factors affecting themicrobial community structure. There was no significant correlation betweenmicrobial α diversity indexes and soil properties. Therefore, under the integrated planting and breeding system in vegetable field, different fertilization treatments changed soil physicochemical and biological properties, and thus drove the changes of composition, structure and diversity of soilmicrobial community.

Integrated planting and breeding system in the vegetable field; Fertilization regimes; Alkaline phosphatase;gene; High-throughput sequencing

10.3969/j.issn.1000-6362.2022.07.003

何宇,呂衛光,鄭憲清,等.菜田種養結合模式下施肥方式對土壤編碼堿性磷酸酶基因微生物群落的影響[J].中國農業氣象,2022,43(7):538-550

2021?09?18

上海市科技興農推廣項目[滬農科推字（2021）第2-2號]；國家農業環境奉賢觀測實驗站項目（NAES035AE03）；上海市農業科學院卓越團隊建設計劃項目[農科創卓2022(008)]

白娜玲，副研究員，博士，主要從事微生物生態研究，E-mail：bainaling@saas.sh.cn

何宇，E-mail：646747331@qq.com