重癥肺炎患者外周血NLRP3炎性小體表達水平的變化及臨床意義

劉艷輝 范永會 王建文

重癥肺炎是常見的呼吸系統危重癥，由普通肺炎進展而來，病情重、救治難度大、死亡率高。在重癥肺炎的病情進展過程中，炎癥反應的過度激活是重要的病理生理特征，炎癥反應不僅直接導致肺內病變的進展，還會引起全身炎癥反應、導致全身多個臟器損害，進而加重病情、增加死亡率［1?2］。目前，關于重癥肺炎發病過程中炎癥反應的調控機制尚不完全清楚，深入研究相關的分子機制有助于發現新的臨床診療靶點、具有現實的臨床意義。NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（Nod?like Receptor，Pyrin Domain Containing 3，NLRP3）炎癥小體是調控炎癥反應的重要分子，由模式識別受體NLRP3 及凋亡相關斑點樣蛋白（Apoptosis?asociated Speck?like Pro?tein Containing a CARD，ASC）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶?1（cysteinyl aspartate specific pro?teinase?1，Caspase?1）組成。NLRP3 炎癥小體識別病原菌后發生活化，進而通過Caspase?1 的生物學功能使白介素（interleukin，IL）?1β、IL?18 的前體裂解為具有促炎活性的成熟體，進而介導炎癥反應的級聯放大激活［3］。本研究將以NLRP3 炎癥小體為切入點進行重癥肺炎的分析，具體研究重癥肺炎患者外周血NLRP3 炎性小體表達水平的變化及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018年1月至2021年12月期間平煤神馬醫療集團總醫院收治的72 例重癥肺炎患者和86 例普通肺炎患者，分別作為重癥肺炎組和普通肺炎組，納入標準：①符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》［4］中重癥肺炎或普通肺炎的診斷標準；②留取外周血及血清樣本；③臨床資料完整；④所有患者家屬均知情并簽署同意書。排除標準：①有肺結核、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統疾病病史；②合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病或正在使用免疫制劑、激素的患者；③入院前接受過抗感染治療。另取同期進行健康體檢且取得知情同意的105 名健康志愿者作為對照組。重癥肺炎組中男性42 例、女性30 例，年齡平均（49.51±9.77）歲；普通肺炎組中男性55 例、女性31 例，年齡平均（48.81±9.55）歲；對照組中男性57 例、女性48 例，年齡平均（46.11±8.25）歲。三組間一般資料的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 外周血NLRP3、ASC、Caspase?1 mRNA 表達水平的檢測

入院后取重癥肺炎組和普通肺炎組患者的外周靜脈血3～5 mL，體檢時取對照組志愿者的外周靜脈血3～5 mL，EDTA 抗凝后采用全血RNA 提取試劑盒（北京天根生化公司）提取外周靜脈血中的RNA，采用cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生化公司）將外周血中提取得到的RNA 反轉錄為cDNA，采用熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化公司）對cDNA 中的NLRP3、ASC、Caspase?1進行熒光定量PCR 檢測，按照試劑盒說明書配置PCR反應體系，在熒光定量PCR 儀對NLRP3、ASC、Caspase?1、β?actin 進行PCR 擴增，得到反應的循環曲線及閾值（Ct），以β?actin 為內參，按照公式2?ΔΔCt計算NLRP3、ASC、Caspase?1 的mRNA 表達水平。

1.3 血清IL?1β、IL?18 含量的檢測

入院后取重癥肺炎組和普通肺炎組患者的外周靜脈血3～5 mL，體檢時取對照組志愿者的外周靜脈血3～5 mL，靜置凝血后速度3 000 r/min、半徑5 cm離心10 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附法試劑盒（上海酶聯生物科技公司）檢測IL?1β、IL?18 的含量。

1.4 實驗室指標的檢測

入院后采用血常規儀（南京貝登醫療，型號：BC30S）檢測白細胞計數（WBC）、超敏C 反應蛋白（hs?CRP），采用生化儀檢測降鈣素原（PCT），采用血氣分析儀（美國愛德士，型號：OPTI CCA?TS）檢測pH 值、動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）。

1.5 預后的評估

根據入院后28 d 的生存情況評估預后。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；28 d 累積生存采用K?M 曲線表示，采用log rank 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血NLRP3、ASC、Caspase?1 mRNA表達水平的比較

三組外周血NLRP3、ASC、Caspase?1的mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。NLRP3、ASC、Caspase?1mRNA 表達水平的多組間比較：重癥肺炎組＞普通肺炎組＞對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組間外周血NLRP3、ASC、Caspase?1 mRNA 表達水平的比較（xˉ±s）Table1 Comparison of NLRP3，ASC and caspase?1 mRNA expression levels in peripheral blood among groups

2.2 外周血NLRP3、ASC、Caspase?1 對普通肺炎和重癥肺炎的鑒別價值

外周血NLRP3、ASC、Caspase?1 表達水平指標均能鑒別普通肺炎和重癥肺炎。見表2、圖1。

表2 外周血NLRP3、ASC、Caspase?1 平鑒別普通肺炎和重癥肺炎的ROC 曲線分析Table 2 ROC curve analysis of NLRP3，ASC and caspase?1 levels in peripheral blood in differentiating common pneumonia from severe pneumonia

圖1 外周血NLRP3、ASC、Caspase?1 平鑒別普通肺炎和重癥肺炎的ROC 曲線Figure 1 ROC curve of NLRP3，ASC and caspase?1 levels in peripheral blood in differentiating common pneumonia from severe pneumonia

2.3 各組血清IL?1β、IL?18 含量的比較

三組血清IL?1β、IL?18 的含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；血清IL?1β、IL?18 含量的多組間比較：重癥肺炎組＞普通肺炎組＞對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三組間血清IL?1β、IL?18 含量的比較（±s）Table 3 Comparison of serum IL?1β，IL?18 contents among groups（±s）

表3 三組間血清IL?1β、IL?18 含量的比較（±s）Table 3 Comparison of serum IL?1β，IL?18 contents among groups（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與普通肺炎組比較，bP＜0.05。

組別重癥肺炎組普通肺炎組對照組n 72 86 105 IL?1β（ng/mL）7.61±1.15ab 4.71±0.84a 2.49±0.72 IL?18（ng/mL）9.59±1.03ab 7.79±1.25a 4.14±0.83

2.4 重癥肺炎組患者外周血NLRP3、ASC、Cas?pase?1 與血清IL?1β、IL?18 的相關性

經Pearson 檢驗，重癥肺炎組患者外周血NLRP3、ASC、Caspase?1的mRNA 表達水平與血清IL?1β、IL?18 的含量呈正相關（P＜0.05）。見表4。

表4 重癥肺炎組患者外周血NLRP3、ASC、Caspase?1與血清IL?1β、IL?18 的相關性Table 4 The correlation between NLRP3，ASC，caspase?1 in peripheral blood and serum IL?1β，IL?18 in patients with severe pneumonia

2.5 重癥肺炎組中不同NLRP3 表達水平的患者實驗室指標的比較

根據重癥肺炎組患者外周血NLRP3mRNA 表達水平的中位數將其分為低表達患者（表達水平＜中位數）、高表達患者（表達水平≥中位數）。NLRP3 高表達患者的WBC、hs?CRP、PCT、PaCO2水平高于NLRP3 低表達患者，PaO2水平低于NLRP3低表達患者（P＜0.05），pH 值與NLRP3 低表達患者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 重癥肺炎組中NLRP3 高表達和低表達患者實驗室指標的比較（±s）Table 5 Comparison of laboratory indexes between patients with high and low expression of NLRP3 in severe pneumonia group（±s）

表5 重癥肺炎組中NLRP3 高表達和低表達患者實驗室指標的比較（±s）Table 5 Comparison of laboratory indexes between patients with high and low expression of NLRP3 in severe pneumonia group（±s）

NLRP3高表達低表達t 值P 值n 36 36 WBC（×109/L）19.79±2.25 14.85±1.84 10.198＜0.001 hs?CRP（mg/L）54.19±9.69 40.38±7.78 5.206＜0.001 PCT（ng/mL）9.39±1.32 7.42±1.29 5.851＜0.001 PaO2（mmol/L）81.31±11.32 87.74±12.57 2.269 0.026 PaCO2（mmol/L）50.39±7.51 42.58±6.57 4.696 0.000 pH 值7.36±0.83 7.39±0.94 0.144 0.886

2.6 重癥肺炎組中不同NLRP3 表達水平的患者28 d 累積生存率的比較

重癥肺炎組中NLRP3 高表達和低表達患者28d 累積生存的K?M 曲線見圖2，死亡總人數13人，其中NLRP3 高表達患者死亡10 人、NLRP3 低表達患者死亡3 人。經log rank 檢驗，重癥肺炎組中NLRP3 高表達患者的28 d 累積生存率均低于NLRP3 低表達患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 重癥肺炎組中不同NLRP3 表達水平患者28d 累積生存的K?M 曲線Figure 2 K?M curve of 28d cumulative survival of patients with different NLRP3 expression levels in severe pneumonia group

3 討論

重癥肺炎的救治難度大、預后差、死亡率高［5?6］，因此需要早期識別、盡早治療。炎癥反應的過度激活是重癥肺炎發生發展過程中重要的病理生理變化之一炎癥細胞因子的大量釋放會損傷肺泡上皮細胞、毛細血管內皮細胞，進而影響肺泡換氣功能，最終造成低氧血癥的發生［7?8］。此外，大量釋放的炎癥細胞因子還能進入血液循環，造成全身炎癥反應激活及多臟器功能損害［9?10］。

NLRP3 炎癥小體在炎癥反應級聯放大激活中的調控作用受到廣泛關注，該小體由NLRP3、ASC及Caspase?1 組成，NLRP3 是一類模式識別受體、與病原菌結合后在細胞內招募ASC 并使Caspase?1發生活化，活化的Caspase?1 將IL?1β、IL?18 的前體裂解為具有促炎生物學活性的成熟體，進而參與炎癥反應級聯放大的過程［11?13］。肺炎支原體毒素刺激、PM2.5 暴露對單核細胞、肺組織中NLRP3 炎癥小體具有激活作用［14?15］；放射性肺炎、呼吸機相關性肺炎患者外周血中NLRP3 炎癥小體的表達增加［16?17］。以上結果提示NLRP3 在肺部感染的發生發展過程中起重要作用。本研究的觀察結果顯示：重癥肺炎患者和普通肺炎患者外周血中NLRP3、ASC及Caspase?1 的表達水平均較健康者升高，提示肺炎發病過程中NLRP3 炎癥小體過度激活，這與國內房有福的研究結果一致［18］；進一步比較顯示重癥肺炎患者外周血中NLRP3、ASC 及Caspase?1 的表達水平均高于普通肺炎患者，表明在普通肺炎向重癥肺炎進展的過程中NLRP3 炎癥小體發生了進一步活化。在此基礎上本研究還通過ROC 曲線分析證實外周血NLRP3、ASC 及Caspase?1 的表達水平對普通肺炎和重癥肺炎具有鑒別價值，這是本研究的創新點之一。

本實驗結果顯示：重癥肺炎患者和普通肺炎患者的血清IL?1β、IL?18 含量均高于健康者且重癥肺炎患者的血清IL?1β、IL?18 含量更高，且重癥肺炎患者外周血中NLRP3、ASC、Caspase?1 的表達水平與血清中IL?1β、IL?18 的含量呈正相關，提示在普通肺炎向重癥肺炎發展的過程中IL?1β、IL?18的異常釋放與NLRP3 炎癥小體的活化有關。

為了進一步深入認識NLRP3 炎癥小體在重癥肺炎發生發展中的作用，本研究分析了NLRP3表達水平與重癥肺炎病情及預后的關系。WBC、hs?CRP、PCT 等感染指標以及PaO2、PaCO2等血氣指標用于臨床評估重癥肺炎的病情，本研究的分析結果提示NLRP3 表達增加加重了重癥肺炎感染程度及缺氧程度。同時本研究還通過28 d 生成的情況評估了重癥肺炎患者的預后，NLRP3 高表達患者的28d 累積生存率較低表達患者降低，表明NLRP3 表達增加使重癥肺炎的預后惡化。

綜上所述，重癥肺炎患者外周血中NLRP3 炎癥小體表達增加；高表達的NLRP3 炎癥小體與重癥肺炎病情加重、預后不良有關。