外周血MIR?143、miR?33a水平與膀胱癌臨床病理特征及化療療效的關(guān)系

王麗麗 崔艷歆 崔華碩

近年來隨著居民飲食習(xí)慣和生活方式的改變，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢［1］。膀胱癌是臨床泌尿科中常見的惡性腫瘤之一，具有較高的復(fù)發(fā)率，根據(jù)其腫瘤侵犯程度又可分為非肌層和肌層浸潤性膀胱癌，后者惡性程度更高、病情進(jìn)展跟快、預(yù)后較差。臨床中治療肌層浸潤性膀胱癌多采取手術(shù)治療結(jié)合化療的治療方案。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是由21～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNAs。報(bào)道指出膀胱癌患者體內(nèi)多種miRNAs 表達(dá)水平均存在異常，其腫瘤發(fā)生和發(fā)展可能存在密切聯(lián)系［2］。研究發(fā)現(xiàn)miR?143 在腫瘤疾病中呈低表達(dá)，具有抑癌作用，可通過降低細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5 抑制腫瘤細(xì)胞的生長［3］。另外，在卵巢癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)微小RNA?33a（mi?croRNA?33a，miR?33a）的異常表達(dá)情況，其可能具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。本研究對(duì)膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平與臨床病理特征進(jìn)行觀察，并分析其與化療療效的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至2021年11月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院收治的110 例膀胱癌患者作為膀胱癌組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肌層浸潤性膀胱癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理診斷確診為原發(fā)性膀胱癌［5］；②入院前半年無外科手術(shù)史；③臨床資料完整；④均未接受過放化療。⑤患者或家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②合并內(nèi)分泌疾病者；④復(fù)發(fā)患者；⑤合并全身免疫性疾病者。其中膀胱癌組，男62 例，女48 例，年齡平均年齡（44.37±8.45）歲，。另選取同期體檢健康者50 名作為健康組，其中男28 例，女22 例，年齡平均（44.86±8.89）歲。兩組性別、年齡資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 化療方案

所有膀胱癌患者均采用新輔助化療進(jìn)行治療。方案如下：氟尿嘧啶（廣東三順制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H44024172，500 mg/m2），表柔比星（山東新時(shí)代藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20184161，100 mg/m2）。環(huán)磷酰胺（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20084627，500 mg/m2），21 天為1 療程，一共4 個(gè)療程。化療結(jié)束后14 d對(duì)評(píng)估化療療效。

1.2.2 外周血miR?143和miR?33a表達(dá)水平的檢測

采集空腹靜脈血5 m L，6 000 r/min 離心30 min，離心半徑為12 cm，收集上清液用于血miR?143 和miR?33a 檢測。采用總RNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（杭州海基生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄為c DNA，進(jìn)行RT?q PCR 擴(kuò)增。mi R?143 上游引物：5′?TGAGATGAAGCACTGT?3′，下游引物：5′?ACATCGACTGTAGCATA?3′，mi R?33a 上游引物：5′?GGTTAGATCTTGCTCCAGCCGTTTG?3′，下游引物：5′?GTAAAGCTTGCCCTCCTGTTTCCTG?3′，反應(yīng)體系：10 μL SYBR GreenⅠMaster、1.0 μL 引物、2 μL DNA 模板、8.5 μL RNase?Free H2O；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火35 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次。內(nèi)參基因選擇U6，U6 上游引物：5′?CTTCAATCAGATA GCCAGCAT?3′，下游引物：5′?AGCCAGTTCGTTGTGAGATAAC?3′。

反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，2?ΔΔCt法計(jì)算血miR?143 和miR?33a 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 化療療效評(píng)估

采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST1.0）對(duì)患者的臨床病理療效進(jìn)行評(píng)價(jià)［6］，分為完全緩解（Complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、病情穩(wěn)定（stable disease，SD）、疾病進(jìn)展（progressive disease，PD），其中化療效果良好為CR+PR。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24.0 對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料（）進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以ROC 曲線分析化療療效，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR?143、miR?33a表達(dá)水平的比較

膀胱癌組外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平均低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平的比較（±s）Table 1 Comparison of peripheral miR?143 and mir?33a expression levels between the two groups（±s）

表1 兩組外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平的比較（±s）Table 1 Comparison of peripheral miR?143 and mir?33a expression levels between the two groups（±s）

組別膀胱癌組健康組t 值P 值n 110 50 miR?143 0.20±0.06 1.04±0.32 26.615＜0.001 miR?33a 8.59±2.64 26.85±5.43 28.662＜0.001

2.2 膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系

膀胱癌患者外周血miR?143 表達(dá)水平與膀胱癌患者的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P＜0.05）。膀胱癌患者外周血mi R?33a 表達(dá)與膀胱癌患者的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系（±s）Table 1 the expression of miR?143 and miR?33a in peripheral blood of patients with bladder cancer and their relationship with clinicopathological characteristics（±s）

表2 膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系（±s）Table 1 the expression of miR?143 and miR?33a in peripheral blood of patients with bladder cancer and their relationship with clinicopathological characteristics（±s）

項(xiàng)目性別t 值P 值年齡t 值P 值腫瘤數(shù)量t 值P 值TNM 分期t 值P 值分化程度F 值P 值淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況t 值P 值男女＜50≥50單發(fā)多發(fā)T2 T3～T4低分化中分化高分化是否n 62 48 47 63 68 42 69 41 56 28 26 49 61 miR?143 0.19±0.07 0.21±0.06 1.580 0.117 0.21±0.06 0.19±0.07 1.574 0.118 0.19±0.06 0.21±0.07 1.893 0.114 0.22±0.06 0.18±0.07 3.175 0.002 0.19±0.06 0.21±0.07 0.22±0.06 2.326 0.103 0.19±0.06 0.22±0.07 2.379 0.019 miR?33a 8.76±2.84 8.43±2.46 0.640 0.523 8.82±2.96 7.93±2.39 1.744 0.084 8.29±2.47 8.82±2.79 1.040 0.301 9.95±3.08 6.28±1.87 3.904＜0.001 8.32±2.83 8.62±2.39 8.81±2.43 0.339 0.713 7.39±2.08 9.87±3.45 4.425＜0.001

2.3 膀胱癌患者化療療效的的單因素分析結(jié)果

以miR?143 表達(dá)水平的平均值（0.20）將膀胱癌患者進(jìn)行分組，高于平均值的為miR?143 高表達(dá)組，低于平均值的為miR?143 低表達(dá)組。以miR?33a 表達(dá)水平的平均值（8.59）將膀胱癌患者進(jìn)行分組，高于平均值的為miR?33a 高表達(dá)組，低于平均值的為miR?33a 低表達(dá)組。

膀胱癌患者化療療效均與其TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、miR?143 表達(dá)水平、miR?33a 表達(dá)水平相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 膀胱癌患者化療療效的的單因素分析結(jié)果［n（%）］Table 2 single factor analysis of chemotherapy efficacy in patients with bladder cancer［n（%）］

2.4 膀胱癌患者化療療效的多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示，miR?143 表達(dá)水平、miR?33a 表達(dá)水平均是膀胱癌患者化療療效的主要影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 膀胱癌患者化療療效的多因素分析Table 4 multivariate analysis of chemotherapy efficacy in patients with bladder cancer

2.5 療效分析

110 例膀胱癌患者經(jīng)化療后，其中化療效果無效8 例，化療效果一般54 例，化療效果良好48 例，化療效果良好率為43.64%（48/110）。ROC 曲線分析顯示，外周血miR?143、miR?33a 水平聯(lián)合預(yù)測膀胱癌化療療效的AUC 為0.894，敏感度為0.875，特異度為0.855。見圖1。

圖1 膀胱癌化療療效預(yù)測的ROC 曲線Figure 1 ROC curve for prediction of chemotherapy efficacy in bladder cancer

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程是一個(gè)多基因表達(dá)改變的過程，正常細(xì)胞內(nèi)促癌基因和抑癌基因表達(dá)處于平衡狀態(tài)，而多種抑癌基因的表達(dá)下調(diào)，以及多種促癌基因的表達(dá)上調(diào)，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和分裂失控，使其發(fā)展成為腫瘤細(xì)胞［7］。miRNAs是近年來新發(fā)現(xiàn)的小RNA，轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控基因表達(dá)及細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，且50%以上可作用于腫瘤相關(guān)基因區(qū)域，與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。外周血中mi RNAs 穩(wěn)定性較高，難被RNA 酶降解，因此外周血miRNAs 水平可作為在腫瘤發(fā)展發(fā)展的評(píng)價(jià)中具有重要參考意義。有不少學(xué)者認(rèn)為，miR?143、miR?33a 與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡和分化等過程均可能存在密切聯(lián)系［8?9］。

mi RNA 的作用機(jī)制主要是通過與基因的信使RNA 的非編碼區(qū)結(jié)合，促進(jìn)信使RNA 的降解，導(dǎo)致該基因的表達(dá)下調(diào)。近年來大量研究證實(shí)，miR?143、miR?33a 參與了多種惡性腫瘤進(jìn)展，如LIU 等人發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細(xì)胞中miR?143 表達(dá)水平明顯降低，其可通過靶向抑制人LIM 和SH3 蛋白1表達(dá)，抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［10］。miR?33a 作為一種抑癌基因，研究顯示其與MET?TL3 基因的信使RNA 結(jié)合并使其降解，從而導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶3 基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞增殖［11］。另外，miR?33a 還可有效下調(diào)肝癌中的腫瘤干細(xì)胞比例，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］。本研究結(jié)果說明，miR?143、miR?33a 在膀胱癌中表達(dá)水平均明顯下降，miR?143、miR?33a 可作為抑癌基因發(fā)揮作用。進(jìn)一步分析膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a表達(dá)水平均與其TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。分析其主要原因：①miR?143 可靶向抑制MYB 原癌基因2 抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲［13］；②miR?33a能夠抑制cullin 蛋白關(guān)聯(lián)和NEDD 解離1 和前B細(xì)胞白血病同源盒基因3 等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞遷移，同時(shí)還可抑制上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移［14?15］。

通過對(duì)影響膀胱癌患者化療療效的因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示膀胱癌患者化療療效均與其TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)、miR?143 表達(dá)水平、miR?33a 表達(dá)水平相關(guān)。多因素分析結(jié)果提示膀胱癌患者化療療效與其TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、外周血miR?143、miR?33a 表達(dá)水平明顯相關(guān)。ROC 曲線分析顯示，外周血miR?143、miR?33a 水平聯(lián)合預(yù)測膀胱癌化療療效的AUC 為0.894，敏感度為87.50%，特異度為85.48%。這提示通過監(jiān)測化療后膀胱癌患者的外周血miR?33a 水平可作為預(yù)測其臨床化療療效的重要參考指標(biāo)。

綜上，miR?143、miR?33a 在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮了重要的作用，膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a 水平與其患者TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、化療療效均存在密切聯(lián)系，這提示膀胱癌患者外周血miR?143、miR?33a 水平可作為其化療療效評(píng)估的重要指標(biāo)，并為患者的后續(xù)治療提供重要參考依據(jù)。