PUMA基因在急性髓系白血病患者表達水平及與預后的相關分析

林樟萍 王可環 趙蓮 王小花 譚三陽

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是血液系統常見的惡性腫瘤，惡性程度高，預后不良［1］。目前，關于AML 的發病機制尚不明確，多與遺傳學有關。AML 臨床治療仍以規范化化療為主，但是臨床實踐發現AML 患者的預后存在較大差異［2］。隨著近年來研究深入，AML 發生及發展可能與某些原癌基因存在較大的關聯性，其中P53 上調凋亡調控因子（p53 up?regulated modulator of apoptosis，PUMA）受到高度關注。研究表明，PUMA 屬于Bcl?2 蛋白家族，在多種腫瘤低表達，與誘導細胞的凋亡密切相關［2?3］。盡管目前包括AML在內的多種血液系統腫瘤中已證實PUMA基因高表達，然而PUMA基因與AML 患者的預后是否存在相關性尚未見臨床報道。本研究探討PUMA基因與AML 患者預后的相關性，以期為臨床靶向性治療AML 提供新的可能治療靶點，改善療效及預后。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2016年6月海南省婦女兒童醫學中心收治的100 例急性髓系白血病患者為研究組，其中男68 例，女32 例；年齡平均（37.8±12.3）歲。根據AML 患者PUMA基因表達水平分為2 個亞組：低表達亞組，共76 例，PUMA基因表達標準為2?ΔΔCT≤1.2；高表達亞組，共24 例，PUMA基因表達標準為2?ΔΔCT＞1.2［4］。同時選取急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者骨髓標本100 例為對照組，男55 例，女45 例；年齡平均（40.3±15.4）歲。兩組病例的納入標準：①AML 以及ALL診斷依據WHO 制定的急性白血病分類及診斷標準（2016年）［4］；②骨髓細胞學檢查、流式細胞學檢驗等明確診斷；③全部病例均為首次就診，無激素使用病史；④臨床資料無缺失。兩組病例排除標準：①合并心、肺、肝、腎等嚴重臟器功能不全；②合并有肝癌、胃癌、肺癌等其他組織器官惡性腫瘤；③明確診斷為急性早幼粒細胞白血病（M3）；④研究期內患者家屬自行放棄治療及退出研究、中途轉院等臨床資料不完整者。2 組人群在性別、年齡、體質量指數（body mass index，BMI）、家族腫瘤疾病史等臨床因素比較差異無統計學意義（P＞0.05）。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經過本院倫理委員會審核通過，受試者或家屬簽署知情同意書。

1.2 AML 化療方案

AML 組患者根據分型不同分為：M1 25 例，M2 37 例，M4 15 例，M5 18 例，M6 5 例。本研究中所有AML 患者化療方案均為高三尖杉酯堿+阿糖胞苷（HA）方案，即：HHT 2.5mg/（m?2.D），用7 d，靜脈滴注；Ara?c 150 mg/（m?2.D），用7 d，靜脈滴注。所有AML 患者均治療3 個療程。

1.3 試劑與儀器

紅細胞裂解液、TRIzol 試劑（廣東凱普生物科技公司）；cDNA 合成、熒光定量PCR 試劑盒（美國Sigma 公司）；PCR 引物（武漢博士德生物工程有限公司）；倒置相差顯微鏡（上海美谷分子）；低溫高速離心機（北京卓立漢光儀器有限公司）；ABI 7900PCR 擴增儀（南京貝登醫療股份有限公司）。

1.4 分離骨髓單個核細胞

抽取骨髓后立即放入抗凝試管中，分離白細胞，加入紅細胞裂解液，吹打混勻后靜置10 min，1 000 rpm 速度離心5 min，吸除上清，PBS 洗滌沉淀。

1.5 RNA 提取及cDNA 合成

按照cDNA 合成試劑盒說明書操作，提取RNA 并合成cDNA，-20℃保存備用。

1.6 mRNA 表達

以GAPDH 作為內參，進行PCR 擴增。反應體系總體積為20 μL，反應條件：95℃預變性15 min；94℃30 s，60℃30 s，74℃30 s，共40 個循環；74℃延伸5 min，4℃保存。實時熒光定量PCR 結果采用2?ΔCt表示。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 療效判斷

比較AML 組的2 亞組患者接受3 個化療療程后療效的差異。其中本研究AML 化療的療效判斷標準為［5］：①完全緩解（complete remission，CR）：無貧血、出血、感染或白血病細胞浸潤性表現；血紅蛋白＞90 g/L，白細胞正常或減少，無未成熟細胞，血小板＞100×109/L；原始細胞和早期細胞骨髓中的幼稚細胞（或未成熟細胞）＜5%，正常紅細胞和巨核系。②部分緩解（partial remission，PR）：臨床、血液和骨髓3 個方面中的1 個或2 個方面骨髓不符合CR 標準；骨髓原始細胞和早期幼稚細胞＜20%。③無緩解（no remission，NR）：臨床、血液和骨髓方面未能滿足CR 骨髓中的原始細胞和早期幼稚細胞＞20%，包括無效患者。

1.8 隨訪

所有AML 患者均出院后予以隨訪，隨訪方式為血液科主治醫師門診或電話隨訪，隨訪間隔為2月，隨訪終點為出院后3年或患者死亡，隨訪時間8～36月，平均（19.4±10.5）月。

1.9 統計學分析

使用SPSS 21.0 軟件進行統計分析，符合正態分布的定量資料數值以（）表示，采用成組t檢驗；各分型間PUMAmRNA 表達量比較采取單因素方差分析，組間比較采取LSD?t檢驗。定性資料采取n（%）表示，采用χ2檢驗。采用Kaplan?Meier法繪制總生存期（overall survival，OS）曲線。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PUMA 基因在AML 中相對表達水平的比較

AML 患者PUMA基因陽性率低于對照組（P=0.024），AML 患者PUMA基因mRNA 表達量低于對照組（P=0.013），差異有統計學意義。見圖1。

圖1 兩組PUMA 基因相對表達水平的比較Figure 1 Comparison of the PUMA gene expression levels between 2 groups

2.2 PUMA 基因在AML 各亞型中表達

PUMA基因陽性表達率從高到低順序M2＞M1＞M5＞M4＞M6，差異有統計學意義（P=0.042）。PUMA基因mRNA 表達量高低從高到低順序為M2＞M1＞M5＞M4＞M6，差異有統計學意義（P=0.038）。見表2。

表2 PUMA 基因在AML 各亞型中表達水平比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of the PUMA gene expression levels among different types［n（%），（±s）］

表2 PUMA 基因在AML 各亞型中表達水平比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of the PUMA gene expression levels among different types［n（%），（±s）］

類型M1 M2 M4 M5 M6 n 25 37 15 18 5 PUMA 基因陽性率20（80.00）30（81.08）10（66.67）14（77.78）3（60.00）PUMA 基因mRNA 表達水平0.23±0.03 0.27±0.02 0.16±0.01 0.19±0.02 0.15±0.06

2.3 AML 患者2 亞組療效比較

PUMA基因高表達AML 患者的臨床療效顯著高于PUMA基因低表達AML 患者，差異具有統計學意義（P=0.012）。見表3。

表3 AML 患者不同PUMA 基因表達水平亞組的療效指標比較［n（%）］Table 3 Comparison of the effective indexes between 2 sub?groups in AML patients［n（%）］

2.4 不同PUMA 表達水平的AML 患者的生存分析

Kaplan?Meier 生存分析表明，隨訪3年PUMA高表達的AML 患者OS 優于PUMA低表達的AML患者，差異有統計學意義（P=0.018）。見圖2。

圖2 不同PUMA 表達水平的AML 患者的生存分析Figure 2 The curves of OS of different PUMA gene expression levels in AML patients by survival analysis

2.5 PUMA 基因表達和預后的關系

M1、M2、M4、M5 及M6 各類型AML 患者生存率比較差異無統計學意義（P=0.157），但同一類型AML 患者PUMA基因高表達的生存率高于PUMA基因低表達患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各類型以及同一類型PUMA 基因表達水平不同的AML 患者預后比較［n（%）］Table 4 Comparison of the prognosis among different types of AML and between different PUMA gene expression levels in the same type of AML［n（%）］

PUMA基因高表達AML 患者的生存率高于PUMA基因低表達患者，比較差異有統計學意義（P=0.016）；PUMA基因高表達患者的化療后感染（P=0.047）、化療后復發發生率（P=0.007）低于PUMA基因低表達患者，比較差異有統計學意義；PUMA基因高表達與低表達的AML 患者髓外浸潤發生率比較差異無統計學意義（P=0.191）。見表5。

表5 AML 患者不同PUMA 基因表達水平的預后指標比較［n（%）］Table 4 Comparison of the prognosis between different PUMA gene expression levels［n（%）］

3 討論

AML 的發病機制較為復雜，目前認為至少包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、信號轉導通路的調控等機制。而抑制腫瘤細胞的增殖，促進凋亡是治療惡性腫瘤的常用方法，因此尋找一種新型治療靶點成為目前研究的熱點。最近PUMA基因作為一種新發現的促進凋亡基因受到臨床研究關注。大量研究證實，人類多種腫瘤組織中存在PUMA基因表達減少，促進了腫瘤的發生發展［5?9］。有研究表明，人胃癌細胞中PUMA基因低表達，且PUMA基因與腫瘤細胞的增殖、浸潤和遷移呈負相關［10］。Yan 等學者［11］發現，正常口腔黏膜組織PUMA基因表達陽性率高于口腔癌細胞，與口腔癌生物學行為密切聯系。朱海嘉等［12］研究表明，PUMA基因mRNA 在AML 患者表達量低于對照組人群。Obexer 等［13］研究提示，盡管慢性淋巴細胞白血病患者與健康對照體內PUMA表達水平無顯著統計學差異，但與患者PUMA表達水平與預后存在相關性。

由于急性早幼粒細胞白血病（M3）的臨床治療措施與其他類型AML 患者存在顯著差異，因此M3患者應單獨進行研究分析，故本研究納入的研究對象排除M3 患者。本研究結果提示PUMA基因在AML 細胞生長過程中起到促進凋亡作用，顯著縮短了腫瘤細胞的生存時間，抑制了腫瘤細胞惡性增殖。這一結果與既往研究是一致的［4］。同時結果也顯示，PUMA基因作為重要的抑癌基因，其基因低表達可能與AML 的發生有關。進一步分析結果顯示，不同AML 亞型患者體內的PUMA基因陽性表達率以及基因mRNA 表達量均存在較大的差異，提示不同AML 亞型在相同化療藥物治療時療效存在差異可能與PUMA基因水平差異有關，但待于進一步研究予以證實。本研究結果提示PUMA基因可能與AML 患者對化療藥物敏感性存在相關性，這也值得進一步深入研究分析。有研究表明，PUMA基因表達水平與慢性淋巴細胞白血病多種預后因素存在相關性，在預測患者預后中發揮重要的作用［14?15］。而本研究應用Kaplan?Meier生存分析證實，盡管M1、M2、M4、M5 及M6 各類型AML 患者預后無顯著差異，但是對于同一類型AML 患者而言，PUMA基因高表達的患者預后優于PUMA基因低表達患者，并且PUMA基因高表達的所有類型AML 患者OS 更高，這均證實PUMA基因高表達的AML 患者中短期預后更好。

綜上所述，PUMA基因在AML 患者骨髓中低表達，與患者的預后相關，PUMA基因為AML 的診治提供新思路。但本研究僅分析單個PUMA基因，并未對其他靶基因與相關信號通路進行研究，這也將是今后需要進一步深入探索的方向。