EB病毒感染與胃癌臨床病理特征的相關性

吳景 李曉潔 何杰

胃癌是常見惡性腫瘤之一，其發生與遺傳、環境、飲食、生物及免疫功能等因素相關。EB 病毒（Epstein?Barr virus，EBV）是一種人皰疹病毒，主要感染B 細胞、上皮細胞，也會感染T 細胞和NK 細胞。EBV 感染與許多腫瘤及非腫瘤性疾病關系密切，已證實與鼻咽癌、EBV 感染相關的淋巴瘤、淋巴組織增生性疾病以及胃癌有關。EBV 編碼的小RNA（Epstein?Barr encoded RNAs，EBER）以高拷貝數存在于EBV 感染的細胞核中，Tokuna?ga M 等［1］在1993年提出應用原位雜交檢測EBER證實胃癌EBV 感染。本文通過回顧性分析胃癌組織中EBER 的表達情況，探索其與胃癌臨床病理特征的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集安徽省腫瘤醫院2018年6月至2019年5月胃癌根治性手術切除樣本127 例，均為10%中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋。男性患者93 例，女性患者34 例，年齡范圍31 至85 歲，中位年齡65歲，入選的患者術前均未進行放化療等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑

EBER 探針、原位雜交消化酶、藍染檢測試劑盒、紅色復染液、各清洗緩沖液、脫蠟液、液體封蓋膜、細胞處理液均購自美國羅氏公司。

1.3 方法

腫瘤組織石蠟包埋后3 μm 厚度切片，60℃恒溫箱烤片2 h，Ventana BenchMark XT 全自動染色儀進行全自動原位雜交檢測。檢測過程：組織脫蠟后經熱修復及酶消化，熒光素標記的探針與組織中特異的靶序列進行雜交，加入帶生物素的二抗與鏈酶親合素?堿性磷酸酶混合物結合，底物經顯色后產生藍色沉淀物。用已知陽性組織作為陽性外對照。根據2016年美國癌癥聯合委員會/國際抗癌聯盟（American Joint Committe on Cancer/Union for International Cancer Control，AJCC/UICC）胃癌TNM分期標準（第八版）［2］對所有患者進行病理分期。

1.4 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗及Fisher 精確檢驗法進行組間比較。P＜0.05 示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EBER 在胃癌組織中的表達

EBER 定位于細胞核，表現為藍色信號，呈彌漫性或散在的點狀染色，與紅色襯染的背景形成鮮明對比。127 例胃癌中13 例EBER 陽性，陽性率10.2%。除表達于腫瘤組織區域，EBER 也可見于鄰近腫瘤的異型增生組織中，間質往往伴有多量淋巴細胞浸潤。見圖1。

圖1 EBER 在胃癌中的表達（×100）Figure 1 Expression of EBER in gastric cancer（×100）

2.2 EBER 與胃癌患者臨床病理特征的相關性

不同的lauren 分型之間EBER 陽性率存在差異（χ2=6.290，P＜0.05），在混合性中感染率最高。不同性別、年齡、腫塊部位、腫塊直徑、TNM 分期、淋巴結轉移數之間的EBER 陽性率差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 EBER 與胃癌患者臨床病理特征的相關性［n（%）］Table 1 Correlation between EBER and clinicopathological features in patients with gastric cancer［n（%）］

3 討論

EBV 進入人體在歷經急性期的細胞免疫應答之后，于記憶性B 細胞中終身潛伏。人體不同感染狀態表達不同的抗原，主要有EBV 核心抗體、膜蛋白及小RNA。LMP?1 是其中一種潛伏期膜蛋白，臨床上常用免疫組化法檢測LMP?1 的表達，但LMP?1 多見于B 細胞感染的潛伏Ⅱ型，在胃癌細胞中較少表達或者不表達［3］。而EBER 是EBV 在潛伏期表達最多的病毒基因，通過探針與待測轉錄本結合，可特異性鑒別感染EBV 的細胞，陽性率高達95%，因此，作為EBV 檢測的金標準。

研究報道EBV 相關性胃癌（EBV associated gastric carcinoma，EBVaGC）在胃癌中的比例為6%～12%［4?5］。多數研究顯示，相對于EBV陰性胃癌（Epstein?Barr virus negative gastric carcinoma，EBVnGC），EBVaGC 患者具有獨特的臨床病理特征。 EBVaGC 患者更年輕，更常見于男性，原發性腫塊較小，腸型胃癌較多見，好發于食管胃交界處以及殘胃，并具有較低的臨床分期和更好的整體生存率［4，6?7］。一項全球4599 例患者的薈萃分析顯示，EBVaGC 患者的中位生存期為8.5年，EBVnGC僅有5.3年［4］。本研究并未發現EBV 感染在患者年齡、性別及腫塊大小、腫塊部位以及病理分期上顯著的差異，可能與收集樣本數目有關，擴大樣本量以及樣本種類，可能對結果更具有提示意義；大部分研究認為EBVaGC 淋巴結轉移率低［8］，鑒于大于6 枚的淋巴結發生癌轉移與胃癌臨床預后關系密切，本文在此類型患者中僅發現1 人感染，與文獻報道也相符合。同時本研究發現EBV 感染與lauren 分型有關，在感染的混合性胃癌病例中，EBV 多感染管狀腺癌成分。并且，在富含淋巴細胞浸潤、腺管分化較差的腺癌中也易見EBER 的表達，此類型胃癌稱之為髓樣癌，又叫胃淋巴上皮樣癌，與EBV 感染極為密切［9?10］。研究報道，胃淋巴上皮樣癌由于腫瘤突變負荷增加以及免疫調節分子誘導導致淋巴細胞在腫瘤間質大量富集［11］。這里需要提出的，在癌旁可觀察到異型增生的腺管合并有EBV 感染，這是否與腫瘤發生后免疫功能損傷有關還未可知。

在腫瘤的發生機制上，國內外研究已證實EBV通過表達相關病毒基因逃避機體免疫應答，誘導細胞癌變，在胃癌發生早期發揮重要作用［8］。其根本的分子作用機制可能由于EBVaGC 中大量的基因啟動子發生甲基化，如細胞周期調控基因、凋亡基因、DNA 修復基因、細胞黏附和遷移基因及信號轉導基因等［12?13］。高通量測序發現EBVaGC 存在高頻率的PIK3C 和ARID1A 基因突變［14］，也表明EBV 可能與腫瘤的發生和進展有關。并且EBVaGC 伴隨存在的高擴增的PD?L1 可能導致腫瘤細胞的免疫逃逸［15］。

EBVaGC 是一種在流行病學，病因學，病理類型和分子機制上具有特異性的胃癌，臨床上較少見，EBER 原位雜交有助于對該疾病的診斷，從而為臨床EBVaGC 的篩查、診斷、治療和預后判斷提供可靠的病理學依據。