多囊卵巢綜合征患者血漿外泌體的差異蛋白質組學分析

王宏鋒 張翠蓮 谷保霞 王倩 孫瑩璞

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是以稀發性排卵或者無排卵、高雄激素血癥或胰島素抵抗、多囊卵巢為特征的內分泌紊亂的癥候群［1］。PCOS 是引起育齡女性無排卵性不孕的最常見病因，嚴重影響著患者的生育狀況、生命質量和遠期健康［2］。據統計，PCOS 的全球發病率約為6%～10%，呈現逐年升高的趨勢［3］。PCOS病因和臨床表現的高度異質性導致其臨床診斷和治療方案仍存在諸多爭議［4］。外泌體是細胞之間物質與信息交換的載體，在機體的多種病理生理學過程中均扮演著重要的角色［5］。從血漿外泌體角度去研究PCOS 相關的差異蛋白質組，未見相關報道。因此，本研究擬通過Label?free 定量蛋白質組學技術對PCOS 患者的血漿外泌體差異蛋白進行分析，為深入研究PCOS 的發病機制提供實驗數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取2017年7月至2018年6月于河南省人民醫院就診的60 例PCOS 患者空腹血漿（PCOS 組）及60 名無PCOS 的健康體檢女性空腹血漿（對照組），每例1 mL。每組隨機抽取血漿標本各3 例，用于Label?free 蛋白質組學實驗。每組隨機抽取血漿標本30 例，用于ELISA 驗證實驗。參與本實驗的PCOS 患者均為首次確診病人，且未接受過藥物治療。PCOS 納入標準：2003年歐洲人類生殖及胚胎協會和美國生殖醫學學會制定的多囊卵巢綜合征診斷的鹿特丹標準［6］。PCOS 排除標準：①如果泌乳素水平明顯升高應排除垂體瘤；②高雄激素血癥或明顯的高雄激素臨床表現，應排除非典型腎上腺皮質增生、柯興氏綜合征、分泌雄激素的卵巢腫瘤等。本研究經院醫學倫理學委員會審核及授權，受試者均簽署實驗知情同意書。

1.2 主要實驗儀器及試劑耗材

Optima L?100XP 低溫超速離心機購自美國的Beckman Coulter 公司；H?7650 透射電鏡購自日本的Hitachi 公司；EASY?nLC 1200 納升級液相色譜儀和Q?Exactive 質譜儀購自美國Thermo Scientific公司。質譜級牛胰蛋白酶（批號：90059）和常用化學試劑購自美國Thermo Scientific 公司；Sep?Pak 脫鹽柱（批號：WAT020515）購自美國Waters 公司；CD9 抗體（批號：sc?18869AC）、CD63 抗體（批號：sc?15363）和二抗均購自于美國Santa Cruz 公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號：23225）和肽段定量試劑盒（批號：23275）、人MBL2 ELISA 試劑盒（批號：EHMBL2）購自美國Thermo Scientific 公司；人PZP ELISA 試劑盒（批號：XY?PZP?Hu）購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 血漿外泌體的提取與鑒定

采用超速離心法提取和富集血漿外泌體［7］。利用透射電鏡檢測提取的血漿外泌體囊泡的形狀和直徑。利用Western blot 檢測血漿外泌體標本中特異性標志物蛋白CD9 和CD63 的表達情況。

1.4 血漿外泌體蛋白的裂解

樣品與蛋白裂解液（8 M 尿素，1 μg/mL 抑肽素，5 μg/mL 亮抑蛋白酶肽和1 mM PMSF）按照體積比1∶10 加入；冰水混合物中超聲破碎2 min；冰上蛋白裂解30 min；將裂解產物4℃，12 000 g 離心30 min（離心半徑為6 cm），吸取蛋白上清。

1.5 血漿外泌體蛋白的酶解、肽段純化及定量

吸取150 μg 血漿外泌體蛋白至酶解管，補充蛋白裂解液至150 μL；加入還原劑TCEP 至終濃度10 mM，37℃水浴反應60 min；加入碘乙酰胺儲液至終濃度40 mM，室溫下避光反應40 min；加入7倍體積的100 mM TEAB 緩沖液；按照酶與蛋白比例為1∶50 的質量比加入質譜級牛胰蛋白酶，37℃水浴16 h。利用Sep?Pak 純化色譜柱純化酶解肽段。利用肽段定量試劑盒對純化后的肽段進行定量。

1.6 Label?free 蛋白質組學檢測

調整肽段濃度為0.5 μg/μL，進行液相色譜?質譜分析。數據采集軟件為Thermo Xcalibur 4.0；色譜柱為C18 反相色譜柱（75 μm×25 cm）；色譜總分離時間為180 min；緩沖液A 是2%乙腈，0.1%甲酸；緩沖液B 是80% 乙腈，0.1% 甲酸；流動相流速為300 nL/min；MS 掃描質荷比（m/z）范圍為350～1 300；采集模式選擇DDA 模式；選擇母離子肽段信號中前20 位肽段進行二級質譜分析；一級質譜分辨率為70 000；碎裂方式采用HCD 方式；二級質譜分辨率為17 500；質譜動態排除時間為30 s。差異蛋白篩選的比率（fold change，FC）標準為：FC＞2.0 或者FC＜-2.0，且P＜0.05。

1.7 生物信息學分析和ELISA

利用DAVID 在線數據庫對差異蛋白進行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析。利用STRING 在線數據庫對差異蛋白進行蛋白質相互作用分析。選取可能具有相互作用的差異蛋白進行ELISA 驗證，實驗步驟參考ELISA 試劑盒說明書。

1.8 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析；計量資料以（）描述，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿外泌體的鑒定

透射電鏡顯示，提取的血漿外泌體直徑分布范圍為30～150 nm，純度比較高，見圖1A。Western blot 結果表明，CD9 與CD63 條帶呈現富集趨勢，見圖1B。

2.2 血漿外泌體的差異蛋白質組學分析

篩選出16個PCOS相關的血漿外泌體差異蛋白，包括4個表達上調和12個表達下調的蛋白。見表1。

表1 PCOS 相關血漿外泌體差異蛋白質Table 1 Differential expressed proteins of plasma exosomes related to PCOS

2.3 差異蛋白點的生物信息學分析

差異蛋白的GO 富集分析顯示，如果按照參與的生物學過程聚類，其主要集中在細菌防御反應、補體激活的經典途徑、B 細胞激活的正向調控等；如果按照細胞組分聚類，其主要富集在細胞外區域、細胞外空間、循環的免疫球蛋白復合體等；如果按照分子功能聚類，其主要富集在免疫球蛋白受體結合活性、抗原結合功能、蛋白酶結合活性，見圖2A。對差異蛋白進行STRING 蛋白質相互作用分析發現，PZP/MBL2/CHFR1/HP 可能存在直接的相互作用，見圖2B。KEGG 通路分析結果顯示，差異蛋白主要富集在補體和凝血級聯反應信號通路。見圖3。

圖2 PCOS 血漿外泌體差異蛋白的生物信息學分析Figure 2 Bioinformatic analysis of changed proteins in plasma exosomes of PCOS

圖3 PCOS 血漿外泌體差異蛋白的KEGG 通路分析Figure 3 KEGG pathway analysis of changed proteins in plasma exosomes of PCOS patients

2.4 ELISA 驗證

選取妊娠帶蛋白（pregnancy zone protein，PZP）和甘露糖結合凝集素2（mannose binding lec?tin 2，MBL2）進行ELISA 驗證，結果顯示，PCOS 組血漿外泌體中PZP 蛋白濃度（370.9±123.5 ng/mL）高于對照組（128.2±29.9 ng/mL），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4A。 PCOS 組血漿外泌體中MBL2 蛋白濃度（8.4±6.1 ng/mL）低于對照組（16.5±3.3 ng/mL），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4B。

圖4 PZP 和MBL2 的ELISA 實驗驗證Figure 4 ELISA experimental validation of PZP and MBL2

3 討論

國內外學者對PCOS 的蛋白質組學研究，多采用卵巢組織或者血漿作為研究標本。以卵巢組織作為研究對象可以反映PCOS 的組織學變化，但是無法發現疾病早期的預警性標記物；以血漿作為研究標本，雖然采集方便、無創傷性，但是最大的缺點是血漿高豐度蛋白對低豐度蛋白的干擾較大［8］。PCOS 發病過程中伴隨著大量分泌蛋白譜的變化，因此，本研究從血漿外泌體角度去探索PCOS發病機制相關的差異蛋白質組，蛋白譜相對簡單，有利于篩選PCOS 發病相關的功能性蛋白質。

差異蛋白的GO 富集聚類分析表明，其主要參與了細菌防御反應、經典的補體激活途徑、B 細胞激活的正向調控等生物學過程，推測差異蛋白可能參與了機體對PCOS 的免疫調控過程和代償性應激反應［9］。差異蛋白的細胞組分聚類分析顯示，其主要富集在細胞外區域、細胞外空間、循環的免疫球蛋白復合體等，預測結果也反映了本研究所用的血漿外泌體提取方法是成功的。差異蛋白的分子功能聚類分析表明，其主要富集在免疫球蛋白受體結合活性、抗原結合功能、蛋白酶結合活性等，免疫球蛋白結合活性及抗原結合活性主要與機體的免疫調控過程相關，蛋白酶結合活性可以抑制蛋白酶對機體某些蛋白的降解，推測PCOS 的發病機制可能與機體的免疫功能紊亂密切相關，與國內外的相關研究報道一致［10］。KEGG 通路分析發現差異蛋白主要富集在補體和凝血級聯反應信號通路，從另一個側面反映了機體免疫調控通路在PCOS 發病過程中的重要性。

針對PCOS 差異蛋白的STRING 相互作用分析發現，PZP/MBL2/CHFR1/HP 可能以蛋白質復合體的形式參與PCOS 的發生發展。因此，后續的ELISA 驗證實驗選取了PZP 和MBL2 進行蛋白表達量驗證。PZP 是一種免疫抑制蛋白，在胎盤和免疫細胞中均有表達。有研究報道，PZP 在阿爾茨海默病人的血清中表達升高［11］，在支氣管擴張患者的痰液中也表達上調［12］，另外，在炎癥性腸病的血清外泌體中也檢測到PZP 蛋白的增高，可作為炎癥性腸病診斷的標記物［13］。本研究的蛋白質組學和ELISA 實驗結果，均發現PZP 在PCOS 的血漿外泌體中表達上調，提示PZP 可能作為免疫抑制蛋白參與了PCOS 的發病過程。MBL2 是一種存在于血清中的C 型凝集素，主要是通過結合病原生物表面的甘露糖等糖基受體發揮調理吞噬作用，或者通過MBL 途徑激活補體，在機體的固有免疫應答過程中發揮重要功能［14］。MBL2 基因突變與感染性疾病、自身免疫性疾病、腎臟疾病均有一定的相關性［15］。本研究發現，MBL2 在PCOS 的血漿外泌體中表達下調，與定量蛋白質組學的實驗結果趨勢一致，推測MBL2 可能通過減少MBL途徑的補體激活進而抑制機體的免疫水平，促進PCOS 的病理生理學進展。

綜上所述，本研究通過非標記定量蛋白質組學方法篩選出與PCOS 發病相關的差異蛋白質，PZP 和MBL2 有希望成為未來研究PCOS 發病機制的新靶點，但是需要針對性地設計后續的功能學實驗進行深入的研究。