一種抗仔豬產毒大腸桿菌卵黃抗體的制備及效果評價

劉光輝

（濱州職業學院，山東 濱州 256603）

1周齡內仔豬因其腸道內尚未建立穩定的微生態系統，自身抵抗力較低，對外界環境刺激敏感，易受各種病原微生物的侵襲和各種應激因素的影響[1]。引起仔豬腹瀉的傳染性因素主要是指傳染性病原，有病毒性和細菌性。而細菌性腹瀉主要是由大腸桿菌引起，其中產腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌，主要發生于 1周齡內仔豬，以 1～3日齡最為常見，發病率和死亡率均很高，給養豬業帶來重大損失[2]。卵黃抗體（lmmunoglobulin of yolk，IgY）是一種從免疫禽類后，從禽蛋中提取的特異性杭體，蛋雞免疫后一個月內可獲得的IgY抗體量是免疫兔子的18倍[2]，因此，制備一種除疫苗之外的生物制品，并且即簡單經濟，又能夠快速獲得足量抗體效價使機體免受感染或獲得最大保護，卵黃抗體無疑是一種良好的選擇[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蛋雞 采用仔豬大腸桿菌 K88、K99雙價基因工程活疫苗免疫SPF蛋雞。

1.1.2 免疫抗原 采用當地仔豬大腸桿菌性腹瀉發病豬腸道分離物、腸毒素及黏附性菌毛蛋白混合成免疫原對SPF蛋雞進行免疫。

1.1.3 提取復合含卵黃抗體 在免疫過程中喂食屎腸球菌Anp01（Enterococcus faecium Anp 01）及中藥混合物[5]，提高被免疫雞的免疫力，然后收集其所產雞蛋，從其蛋黃中提取抗仔豬大腸桿菌性腹瀉復合卵黃抗體。

1.2 方法

1.2.1 免疫原制備 采用本地的患仔豬大腸桿菌性腹瀉或流行性腹瀉比較嚴重的仔豬進行時捕殺，取出小腸組織剪碎、研磨，用于提取和純化，加 0.01MPBS（pH7.5）稀釋，反復凍融，離心，取上清液加入6 % PEG-6000和2 % NaCl，放置后再離心，將沉淀重懸于PBS中，離心后取上清液進行超速離心。將沉淀重懸于PBS中，即為產腸毒素大腸桿菌、腸毒素及黏附性菌毛蛋白混合免疫原。

1.2.2 對產蛋雞進行免疫 用上述制備的免疫原對 SPF產蛋雞進行肌肉免疫。程序為：取 18～20周齡的 SPF蛋雞，飼喂一周后，進行首次免疫，所述的免疫的方法為：免疫雞分別分點注射仔豬大腸桿菌病 K88、K99雙價基因工程活疫苗及混合免疫原，在首次免疫后第 14天、第 28天、第56天分別進行2次免疫和3、4次免疫，所述的首次免疫、2次免疫和3、4次免疫的處理方法相同，首免和第 2次免疫，分別注射仔豬大腸桿菌病 K88、K99雙價基因工程活疫苗及混合免疫原1 ml；再隔2周進行第3次免疫，注射疫苗及混合免疫原2 ml；再隔4周后進行第4次免疫，分別注射疫苗及混合免疫原4 ml。

1.2.3 添加屎腸球菌Anp01及中藥混合物 免疫雞在飼喂過程中添加屎腸球菌 Anp01（添加量0.1 %）及中藥混合物，中藥混合物組成為：生黃芪 15 g、銀花 15 g、柴胡 10 g、黃芩 10 g、板蘭根 15 g、貫仲 15 g、蒼術 10 g、生苡仁 15 g、防風 10 g、生甘草 5 g、藿香 10 g，粉碎飼喂，添加量為10 %，以提高免疫雞群機體免疫力。

1.2.4 卵黃抗體分離提純 首免 6周后收集所產雞蛋，經 75 % 酒精消毒后，用卵黃分離器分離出卵黃，與等量 PBS混合后勻漿，聚乙二醇（PEG-6000）沉淀法提純卵黃抗體；所述用聚乙二醇（PEG-6 000）沉淀法提純的程序為：依次分別用3.5 % PEG-6000、8.5 % PEG-6000、12 %PEG-6000對卵黃抗體沉淀 3次，最后用預冷的50 % 乙醇進一步沉淀，收集上液，經0.22 μm濾膜過濾后，所得為純化后的仔豬大腸桿菌性腹瀉抗體IgY。

2 結果與分析

2.1 卵黃抗體的制備結果

實驗制備抗仔豬產毒大腸桿菌卵黃抗體要求純度≥95 %，瓊脂擴散試驗測定卵黃抗體效價≥1:64。

2.2 卵黃抗體對仔豬死亡率的影響

取 1日齡未吃初乳仔豬 12頭，隨機分成 4個小組，分別為攻毒治療組（4頭），攻毒不治療組（4頭），不攻毒治療組（2頭），不攻毒不治療組（2頭）。攻毒所用菌株為產腸毒素大腸桿菌（ETEC）10倍稀釋，給攻毒組 0.2 ml/頭直接口服，治療所用卵黃抗體為提純樣品，同樣口服飼喂 2 ml/d，對照組飼喂頻次數量相等的生理鹽水，根據各組臨床癥狀及死亡率及糞便情況來判斷TGEV卵黃抗體的治療效果。

攻毒治療組、不攻毒治療組合和對照組仔豬生長正常，飼喂卵黃抗體與否對其生長沒有影響，沒有出現死亡，攻毒不治療組 4 d內全部死亡，實驗結果見表1。

表1 4組實驗仔豬攻毒后死亡對比實驗

2.3 卵黃抗體對仔豬攻糞便的影響

攻毒治療組在攻毒后 1～3 d出現輕度腹瀉，第 4天以后恢復正常，攻毒不治療組仔豬均出現嚴重的腹瀉癥狀，表現為黃色水瀉，仔豬迅速消瘦脫水，而卵黃抗體治療組第 2天仔豬腹瀉癥狀則明顯減輕，排泄出的糞便自黃色稀便轉變為黏稠軟便，1周后逐漸恢復，未出現死亡情況，實驗結果見表2。

表2 4組實驗仔豬攻毒后糞便對比實驗

3 討論

仔豬細菌性腹瀉具有較強的傳染性，并且仔豬感染后死亡率比較高，是養豬業比較棘手的問題。當仔豬感染產腸毒素大腸桿菌后，仔豬的小腸黏膜受損嚴重，直接影響機體對營養的消化吸收，如果不能第一時間得到治療，常因劇烈水樣腹瀉和代謝性酸中毒而死亡。此類疾病必須盡早治療，以確保達到預期效果[6]。

卵黃抗體制劑為雞的免疫球蛋自，能夠特異性的中和 ETEC致病菌[7]。同時，添加的屎腸球菌和中藥混合物對仔豬消化系統有營養和修復作用。可用于治療臨床上由 ETEC感染導致的仔豬腹瀉，對于末感染的仔豬可以起到積極的預防和保護作用，有助于第一時間改善仔豬發病狀況。

4 結論

制備的仔豬產毒大腸桿菌卵黃抗體可有效預防和治療仔豬產毒大腸桿菌感染，具有較好的臨床應用價值。