針刀干預(yù)對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔原代軟骨細(xì)胞活性、凋亡及自噬的影響

修忠標(biāo) 劉 洪 張良志 劉 晶 林巧璇 盧莉銘 郭澤興 楊金碩

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院骨傷一科，福建福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院骨傷科，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院骨傷科，福建福州 350003

中醫(yī)原創(chuàng)微創(chuàng)技術(shù)針刀療法治療膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）效果明確，已被多個(gè)KOA臨床診療指南推薦[1-2]，然而其具體作用機(jī)制尚不明確。既往研究表明，筋骨失衡引起的異常機(jī)械應(yīng)力可通過(guò)調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬和凋亡水平參與KOA 軟骨退變[3-4]。而針刀可恢復(fù)膝周骨骼肌、韌帶功能，調(diào)整膝關(guān)節(jié)力學(xué)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)筋骨平衡，延緩軟骨病理改變[5-7]。針刀治療KOA 軟骨保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬和凋亡水平相關(guān)，團(tuán)隊(duì)前期已從軟骨組織學(xué)層面證實(shí)，針刀可減少KOA 兔細(xì)胞凋亡，改善軟骨病理形態(tài)[8-9]，本研究將進(jìn)一步從原代軟骨細(xì)胞活性、凋亡和自噬等層面來(lái)探討針刀改善KOA 退變的治療機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通健康雄性6 月齡新西蘭大白兔24 只，體重（2.5±0.5）kg，購(gòu)于上海松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0008]，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007]代購(gòu)并飼養(yǎng)。單籠喂養(yǎng)，自然光照，自由進(jìn)食、飲水，室溫（23±2）℃。本研究通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：FJTCMIACUC），整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的各種處理均遵照科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》有關(guān)動(dòng)物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與主要儀器

戊巴比妥鈉（上海上藥新亞有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：811B025）；胰蛋白酶（德國(guó)Biofroxx 1004GR100）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone D6429）；胎牛血清（澳大利亞Gibco 10099）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：P1110）；雙抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：SV30010）；CCK-8 法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C0038）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有效公司，貨號(hào)：KGA108）；anti-LC3B 抗體（廣州徠智生物科技有限公司，貨號(hào)：bs-2912R）。一次性使用0.4 mm×40 mm 無(wú)菌小針刀（江西老宗醫(yī)醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：20172270270）；AX002 型高分子石膏（陜西安信醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)有限公司）；KL-T1 型自動(dòng)脫水機(jī)（湖北康龍電子科技有限責(zé)任公司）；BMJ-A 型組織包埋機(jī)（常州中威電子儀器）；RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；YT-CJ-2NB 型超凈工作臺(tái)（北京亞泰隆）；DH-160 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤儀器Ⅰ）；DSZ2000X 型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器）；SL02 型低速離心機(jī)（知信儀器）；RAD SPEED型數(shù)字化拍片系統(tǒng)（日本島津DR 機(jī)）；NIB900-FL 型倒置熒光顯微鏡（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；離心機(jī)（Labofuge 400R）；CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀（貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按體重進(jìn)行編號(hào)，并應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組、模型組、針刀組，每組8 只。模型組、針刀組采用本團(tuán)隊(duì)前期研究的改良Videman 法[13]固定，左后肢膝關(guān)節(jié)伸直中立位0°放置石膏托，使用高分子石膏繃帶、防啃咬繃帶環(huán)繞，使膝關(guān)節(jié)固定于伸直中立位0°，踝關(guān)節(jié)背曲60°塑形，固定6 周[9]。空白組不予處理。

1.3.2 干預(yù) 造模成功后，根據(jù)《中國(guó)經(jīng)筋學(xué)》中關(guān)于膝關(guān)節(jié)經(jīng)筋病變規(guī)律及整合相關(guān)文獻(xiàn)分析[10-12]，選取常見病灶點(diǎn)“鶴頂次（股四頭肌肌腱髕骨上緣附著處）”“髕內(nèi)下（髕內(nèi)側(cè)支持帶髕骨內(nèi)下緣附著處）”“髕外下（髕外側(cè)支持帶髕骨外下緣附著處）”“成腓間（外側(cè)關(guān)節(jié)間隙中膝外側(cè)副韌帶處）”“委陽(yáng)次（股二頭肌內(nèi)側(cè)緣）”“陰陵次（鵝足腱脛骨內(nèi)側(cè)止點(diǎn)處）”，常規(guī)消毒鋪巾，采用一次性無(wú)菌小針刀干預(yù)，垂直治療點(diǎn)皮膚進(jìn)針直至抵達(dá)病變處，松解范圍應(yīng)＜0.5 cm。干預(yù)周期為1 個(gè)月，每周干預(yù)1 次。其余兩組不予特殊處理。通過(guò)X 線檢測(cè)對(duì)造模兔進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)間隙變窄、周圍骨贅形成表明造模成功[13]。見圖1。

1.3.3 原代軟骨細(xì)胞提取和鑒定 干預(yù)結(jié)束1 周后，對(duì)各組8 只新西蘭兔進(jìn)行原代軟骨細(xì)胞提取和鑒定，分別腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（1.5 ml/kg）麻醉后空氣栓塞法處死，無(wú)菌條件下迅速解剖截取膝關(guān)節(jié)，然后超凈工作臺(tái)上用刀片刮切軟骨至細(xì)小碎塊，轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，加入5 ml 0.02%Ⅱ型膠原酶、5 ml DMEM培養(yǎng)基，放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h；然后通過(guò)篩網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞，離心半徑11.5 cm、1000 r/min 離心5 min，吸去上清，加入2.5 ml 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。然后采用Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光細(xì)胞染色進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定，Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞染色可見軟骨細(xì)胞胞核清晰，呈藍(lán)色[14]。見圖2。

1.3.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性 96 孔板加入空白組、模型組、針刀組原代軟骨細(xì)胞100 μl/孔，向各孔中加入10 μl CCK-8 檢測(cè)溶液，分別在37℃下孵育1、2、4、6、8、12 h，酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 雙染流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡用PBS 分別洗滌空白組、模型組、針刀組原代軟骨細(xì)胞二次，離心半徑11.5 cm、1000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞，加入500 μl 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μl Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)10 min；然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。應(yīng)用FACSdiva 軟件獲取10000 個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行結(jié)果分析，以Annexin V-FITC為橫坐標(biāo)、PI 為縱坐標(biāo)作圖。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 LC3B 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞自噬水平 分別制作空白組、模型組、針刀組的細(xì)胞爬片，PBS 清洗3 次，用4%多聚甲醛固定30 min；PBS 沖洗，加入0.3%曲拉通37℃通透30 min；PBS 沖洗；5% BSA 37℃封閉60 min；PBS 沖洗，滴加1∶100 的一抗LC3B，4℃過(guò)夜；PBS 沖洗，滴加50 μl 抗-LC3B-IgG 標(biāo)記熒光二抗（1∶500），37℃孵育90 min；PBS 沖洗，DAPI 工作液37℃染核10 min；PBS 沖洗，緩沖甘油封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，凋亡率取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組實(shí)驗(yàn)兔情況

實(shí)驗(yàn)期間三組實(shí)驗(yàn)兔狀態(tài)良好，體重與進(jìn)食量基本一致，無(wú)死亡。

2.2 三組兔原代軟骨細(xì)胞CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)比較

三組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；模型組同期細(xì)胞活性低于空白組，針刀組同期細(xì)胞活性高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

2.3 三組兔原代軟骨細(xì)胞Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)比較

模型組軟骨細(xì)胞凋亡率高于空白組（P ＜0.05），針刀組軟骨細(xì)胞凋亡率低于模型組（P ＜0.05）。見圖4、表1。

表1 三組Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞凋亡率比較

2.4 三組兔原代軟骨細(xì)胞LC3B 免疫熒光染色細(xì)胞自噬水平檢測(cè)比較

與空白組比較，模型組LC3B 熒光強(qiáng)度下降。與模型組比較，針刀組LC3B 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。見圖5。

3 討論

KOA 被認(rèn)為是以關(guān)節(jié)軟骨退行性變、骨贅形成、軟骨下骨增厚、滑膜炎癥、半月板損傷等為特征的慢性退行性疾患。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為筋骨失衡導(dǎo)致的異常機(jī)械應(yīng)力可誘導(dǎo)KOA 軟骨退變。自噬在機(jī)械壓力、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等異常生理?xiàng)l件下對(duì)軟骨細(xì)胞起保護(hù)作用，在調(diào)節(jié)能量和營(yíng)養(yǎng)、維持體內(nèi)能量代謝方面起著至關(guān)重要的作用，可通過(guò)溶酶體對(duì)受損或老化的細(xì)胞器進(jìn)行降解和再利用，提供氨基酸、核苷酸、糖類和脂肪酸來(lái)維持組織穩(wěn)態(tài)[15]，與軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等過(guò)程密切相關(guān)，參與了KOA 重要病理過(guò)程[16]。因此，糾正關(guān)節(jié)軟骨表面異常機(jī)械應(yīng)力分布和改善軟骨免疫微環(huán)境治療KOA 有效途徑[17-18]。

中醫(yī)多從“筋骨”角度來(lái)認(rèn)識(shí)KOA，《素問·痿論》曰：“宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)也。”足三陽(yáng)經(jīng)筋和足三陰經(jīng)筋環(huán)繞膝周，各經(jīng)筋之間相互協(xié)調(diào)，從而保證關(guān)節(jié)屈伸功能。KOA 的發(fā)病與經(jīng)筋失衡（骨骼肌、韌帶損傷和神經(jīng)支配功能障礙），筋骨力學(xué)結(jié)構(gòu)改變，繼而軟骨退變密切相關(guān)[19]。團(tuán)隊(duì)前期梳理經(jīng)筋理論，研究表明“橫絡(luò)痹阻、筋骨失衡、氣血失和”是KOA 關(guān)鍵病機(jī)，通過(guò)針刀松解膝周經(jīng)筋病灶點(diǎn)“解結(jié)橫絡(luò)”，以“調(diào)衡筋骨、調(diào)和氣血”，從而有效治療KOA[20]。

自噬作為一種高度保守的細(xì)胞行為，對(duì)于維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)促進(jìn)細(xì)胞存活具有重要意義[21]。研究表明[22-23]，軟骨細(xì)胞自噬水平的升高能夠有效抑制軟骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，針刀治療能夠提高軟骨細(xì)胞自噬水平，且對(duì)于軟骨細(xì)胞增殖活性起到促進(jìn)作用，進(jìn)一步抑制軟骨細(xì)胞凋亡。軟骨細(xì)胞凋亡是KOA 膝關(guān)節(jié)軟骨退變機(jī)制中的重要一環(huán)[24-26]，軟骨細(xì)胞凋亡受到多種蛋白調(diào)控，但其具體機(jī)制尚不明確[27-28]。本研究結(jié)果顯示，針刀治療能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)軟骨的保護(hù)作用。然而，針刀是通過(guò)何種途徑對(duì)軟骨細(xì)胞自噬和凋亡產(chǎn)生影響，尚需進(jìn)一步探索和研究。