抑制Rictor 對膿毒癥小鼠心肌自噬水平的影響

蔣萬威 楊國輝

貴州醫科大學臨床醫學院，貴州貴陽 550004

心臟是膿毒癥常見的靶器官，超過1/4 的膿毒癥 心肌損傷患者在28 d 內死亡[1-2]。超過10%的患者可進一步發展為膿毒癥性心肌病，長期影響患者的心臟功能[3-4]。自噬作為機體在應激時的保護機制之一，可清除受損細胞器或病原體，處于多種穩態途徑的十字路口[5-6]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路是自噬的主要調控通路之一，其表達水平的上調可抑制自噬。本研究利用盲腸結扎穿孔術（cecum ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥急性心肌損傷小鼠模型，使用雷帕霉素不敏感的Rictor 特異性抑制劑干預，研究膿毒癥時Rictor 對心肌細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF 級昆明種小鼠36 只，6～7 周齡，體重40～60 g，購于貴州醫科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK（黔）2018-0001，合格證：110324210104222 683]，實驗操作符合動物倫理要求（2001133）。

1.2 實驗試劑及儀器

主要實驗試劑：Rictor 抑制劑JR-AB2-011（美國Aobious 公司，批號：AOB31722）；LC3B 抗體、Akt（pan）抗體、磷酸化Akt（phospho-Aktser473）抗體、Rictor 抗體（美國CST 公司，批號：#2775、#4685S、# 4071S、#9476S）；Raptor 抗體、GAPDH 抗體（美國Bioword 公司，批號：AP1001、BS65483M）。

主要實驗儀器：蛋白電泳及轉印系統（美國BIORAD 公司，型號：Mini-PROTEAN）；化學發光成像系統（美國Syngene 公司，型號GeneGnome XRQ）；全自動生化儀（美國Abbott 公司，型號：ARCHITECT 8000）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型及實驗分組 采用隨機數字表法將小鼠分為假手術組、模型組、實驗組，每組12 只。術前禁食12 h，不禁飲。使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹部正中逐層切開暴露盲腸。模型組及實驗組在盲腸遠端1/2 處結扎，并用7 號針頭于不同部位貫穿兩次，擠壓穿孔部位使腸內容物溢出少許，還納盲腸并逐層縫合；假手術組暴露盲腸后直接還納。術后實驗組給予JR-AB2-011 10 mg/kg 腹腔注射[7]，假手術組及模型組給予同等劑量的生理鹽水。造模成功標準：小鼠CLP 術后蘇醒延遲、反應遲鈍、精神萎靡、活動明顯減少，進食、進飲減少，呼吸頻率加快；剖腹可見惡臭味血性滲液，腸管水腫粘連，盲腸結扎遠端壞死變黑。

1.3.2 標本收集 術后12 h 及24 h 分別取各組6 只小鼠，麻醉后腹主動脈采血0.3 ml，開胸摘取小鼠心臟。全血分離血清后-80℃保存，取心尖組織進行蛋白表達水平檢測及組織形態學檢測。

1.3.3 心肌損傷標志物檢測 使用全自動生化分析儀檢測血清心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）及肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）水平。

1.3.4 心肌組織相關蛋白檢測 使用SDS 提取小鼠心肌組織蛋白，利用蛋白凝膠電泳及濕轉法將目的蛋白轉印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，使用Rictor（1∶1000）、panAkt（1∶1000）、Phospho-Aktser473（1∶2000）、Raptor（1∶1000）、LC3B（1∶1000）、GAPDH（1∶5000）4℃孵育過夜。對應二抗室溫孵育1 h 后顯影。

1.3.5 心肌組織病理學檢查 取小鼠心尖組織，于10%甲醛及2.5%戊二醛固定，前者使用HE 染色后掃描電鏡下觀察，后者于透射電鏡下觀察。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料用例數表示。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組cTnI、CK-MB 水平比較

模型組各時間點cTnI、CK-MB 水平高于假手術組；實驗組各時間點cTnI、CK-MB 水平低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組cTnI、CK-MB 水平比較（）

表1 各組cTnI、CK-MB 水平比較（）

注 與假手術組同期比較，aP ＜0.05；與模型組同期比較，bP ＜0.05。cTnI：心肌肌鈣蛋白I；CK-MB：肌酸激酶同工酶

2.2 各組心肌組織蛋白表達水平比較

模型組各時間點Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 高于假手術組；術后12 h，模型組LC3B 高于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。實驗組各時間點Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 低于模型組，LC3B 高于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖1、表2。

表2 各組心肌組織蛋白表達水平比較（）

表2 各組心肌組織蛋白表達水平比較（）

注 與假手術組同期比較，aP ＜0.05；與模型組同期比較，bP ＜0.05

2.3 各組心肌組織形態學觀察

假手術組心肌組織排列正常；模型組可見心肌纖維中度水樣變性；實驗組可見少量心肌纖維水樣變性，細胞腫脹（圖2A）。透射電鏡下，模型組及實驗組均可觀察到自噬體及自噬溶酶，后者更為顯著（圖2B）。

3 討論

膿毒癥強烈的免疫和炎癥反應，直接誘導了心肌細胞損傷的發生，進一步發展為膿毒癥心功能障礙，是患者死亡的重要原因之一[8]。高達50%的膿毒癥休克患者合并膿毒癥心功能障礙，早期出現的心肌細胞損傷和心功能障礙，常提示患者的預后不良[9-10]。除膿毒癥本身所致的心肌損傷外，還包括并發的低氧血癥、酸中毒、代謝紊亂及免疫系統功能異常等多方面因素，共同構成了心肌細胞復雜的損傷機制[11-13]。cTn水平升高常提示心肌細胞損傷，可用以判斷膿毒癥患者心肌損傷程度及預后[14]。本研究結果顯示，膿毒癥小鼠血清cTnI、CK-MB 水平在早期即明顯升高，提示心肌細胞損傷的發生。

自噬作為機體的保護機制之一，參與受損細胞及細胞器的修復、回收、再利用等過程，減輕組織器官的損傷；自噬在膿毒癥中起到保護心肌細胞及清除受損細胞器的作用，自噬不足會引起心肌細胞損傷的增加[15-16]。當病原微生物入侵機體后，多個自噬信號通路被激活，從而增強自噬水平，減輕炎癥反應的強度，并改善及控制感染[17-18]。PI3K/Akt/mTOR 作為自噬抑制通路在膿毒癥患者中表達水平升高，抑制自噬水平，限制了組織器官的自我修復[19-20]。

膿毒癥合并心肌損傷患者自噬水平更低，心肌細胞損傷顯著，其潛在機制可能是通過mTOR 的調控實現的[1,21]。當膿毒癥發生后，胰島素樣生長因子通過PI3K 活化mTORC2[22]，Rictor 作為其關鍵組成部分，活化Akt 并增強mTORC1 的表達水平，發揮自噬負調控作用[23-25]。本研究結果顯示，該信號通路在小鼠心肌組織中被激活，Rictor 表達升高，Akt 磷酸化增加，限制了LC3B 的活化、抑制自噬；通過抑制Rictor 的表達，LC3B 的表達水平明顯提高，自噬小體及自噬溶酶體增多，心肌酶下降，體現了自噬對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，膿毒癥中自噬水平的不足加劇了心肌細胞損傷的程度，通過抑制Rictor 可提高心肌細胞的自噬水平，有利于清除受損的細胞器，減少壞死及凋亡的發生，從而減輕因膿毒癥導致的心肌細胞損傷。