基于PET效應檢測8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶的熒光傳感器

劉 萍，金 東，李哲建，喬成芳

（1.商洛學院 化學工程與現代材料學院，陜西 商洛 726000；2.陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室，陜西商洛 726000；3.南京郵電大學 材料科學與工程學院，江蘇 南京 043000）

生物體的生命活動經常會受到內、外致突變因素的影響，引起DNA 堿基損傷。8-氧鳥嘌呤（8-oxoG）是DNA氧化損傷的重要標志［1］。8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）是一類存在于生物體內能夠參與DNA 損傷修復過程的蛋白酶，可與DNA 雙鏈進行非特異性結合，選擇性識別并切除DNA 雙鏈中的8-oxoG，形成脫嘌呤（AP）位點，并在一系列修復酶協助下完成DNA 分子的修復［2］。人體中8-氧鳥嘌呤DNA 糖基化酶（OGG1）稱為hOGG1。研究表明：OGG1的異常與多種疾病以及癌癥密切相關［3］，其已成為多種疾病發展狀態的重要標志物和癌癥的潛在治療靶點，因此實現對OGG1 活性的快速、靈敏檢測對于基礎生化研究和臨床醫學發展具有十分重要的意義。

檢測OGG1 的傳統方法有凝膠電泳法［4］、放射性檢測法［5］、高效液相色譜法（HPLC）［6］、比色法［7］、電化學法［8］和熒光分析法［9-10］等，如蔣健暉課題組［7］基于探針末端保護原理，利用表面修飾寡核苷酸的AuNP作為識別探針，發展一種檢測hOGG1活性的比色分析法。Liu等［8］基于hOGG1對8-oxoG 的識別特性，設計了包含8-oxoG及亞甲基藍分子（MB）的DNA探針，利用方波伏安法（SWV）表征hOGG1的活性，將酶活性成功轉化成物理信號輸出，建立了目標蛋白與電化學信號之間的量化關系，構建了靈敏的hOGG1 電化學傳感器。劉斌等［9］利用標記熒光的發夾結構分子信標，設計含有8-oxoG 且有標記的雙鏈DNA，利用hOGG1的特異性功能解鏈，再用適體與解旋鏈形成復合物，通過實時監測8-oxoG 切割過程建立了一種hOGGl 活性分析的新方法。李峰課題組［10］發展一種核酸外切酶ExoⅢ輔助的等溫循環信號放大策略，實現了對hOGG1活性的熒光檢測。但多數方法存在靈敏度差、操作復雜、分析耗時、儀器昂貴、污染環境等不足，極大地限制了方法的推廣應用。

本文基于G堿基與羧基熒光素（FAM）產生光誘導電子轉移（PET）效應［11-12］，利用OGG1酶能特異識別含有8-oxoG 的雙鏈DNA 的特點，建立了一種檢測OGG1 酶活性的熒光新方法。該方法具有操作簡便、成本低等優點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4600 型日立熒光分光光度計（日本日立公司），便攜式pH 計、XS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），TGL-18C離心機（上海安亭科學儀器廠），移液槍（北京大龍公司），恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司）。

三（羥甲基）氨基甲烷（Tris，上海青析化工科技有限公司），NaCl、EDTA、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司），MgCl2、Cd（NO3）2·4H2O（上海麥克林生化科技有限公司），均為分析純；實驗用水為Milli-Q超純水（18.2 MΩ·cm）。

8-氧鳥嘌呤糖基化酶（OGG1）、10×NEB緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 1，4-二硫蘇糖醇（DTT），pH 7.0）、100 × 牛血清白蛋白（10 mg/mL BSA）購于NEB 公司（New England Bioblabs 公司），尿嘧啶DNA 糖基化酶（UDG）、10 × 反應緩沖液（200 mol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.2）核糖核酸酶（RNase A）、實驗所用DNA序列（表1）均購于上海生物工程股份有限公司。DNA 使用前在10 000 r/min 下離心5 min，然后用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（含1 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制成100μmol/L DNA儲備液，于-18 ℃冷凍保存。

表1 實驗所用的DNA序列（5'-3'）Table 1 DNA sequences used in the experiment（5'-3'）

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 雜交 取5μL 100μmol/L FAM-DNA1 溶液于離心管中，加入5μL 100μmol/L 含G 堿基且與FAM-DNA1 互補的DNA（c-DNA）溶液，用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（含50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）定容至100 μL，充分混合。然后置于水浴中緩慢升溫至95 ℃，保持10 min 后自然降至室溫并孵育30 min，室溫下避光培育過夜，使DNA 充分雜交。2 條單鏈DNA 序列互補，形成穩定的DNA 雙鏈結構，將得到的FAM/dsDNA1 溶液儲存于4 ℃的冰箱中備用。采用同法得到FAM/dsDNA2。

1.2.2 OGG1 的測定 取100μL FAM/dsDNA1 溶液于比色皿中，測定其熒光強度（F0），然后加入不同濃度的OGG1，反應溶液為1×NEB，300 g/mL BSA 的緩沖液，混勻后在40 ℃恒溫水浴中反應2.5 h。待溶液冷卻至室溫后，設置熒光儀的激發波長為490 nm，狹縫寬度為5 nm，激發和發射光倍增管電壓為700 V，在500 ～650 nm 范圍內測定熒光發射光譜強度（F）。根據加入OGG1 前、后體系熒光強度的差值ΔF（ΔF=F-F0）測定OGG1的濃度。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

基于G堿基對熒光染料的猝滅效應以及OOG1對8-oxoG的識別和切除作用，以1條5'末端標記羧基熒光素且含有8-oxoG 的DNA 鏈為信號探針，1 條3'末端含多個G堿基的互補序列作為猝滅基團，當2 個鏈雜交后G 堿基末端會接近FAM，從而引發有效的光誘導電子轉移，導致熒光猝滅。當體系中加入OGG1，其將受損G堿基剪切后DNA 序列產生缺口，較短的帶有FAM 信號的DNA 片段由于熔化溫度降低從互補鏈上解旋下來，釋放出FAM 的熒光信號，導致體系熒光增強。根據加入OGG1 前、后體系的熒光強度變化可實現對OGG1的活性檢測。檢測的實驗原理如圖1所示。

圖1 實驗原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental principles

2.2 傳感器的可行性

為驗證方法的可行性，實驗考察了加入OGG1 前、后反應體系的熒光光譜（如圖2）。結果顯示，FAM-DNA1具有很強的熒光信號，與c-DNA雜交后體系的熒光強度明顯降低，說明形成雙鏈DNA 后G 堿基和FAM之間產生PET效應，猝滅了FAM的熒光；當向底物中加入OGG1 后，熒光強度增強，且加入的OGG1 濃度越大，熒光信號增強越大。說明向猝滅體系中加入OGG1 后，由于酶對oxoG 堿基的識別切除作用，使得雙鏈結構被破壞，熔化溫度降低，釋放出帶FAM 的DNA片段，阻止了PET 過程，體系的熒光強度得到恢復。實驗現象與設計的原理相一致。

圖2 不同條件下FAM-DNA1的熒光光譜Fig.2 Fluorescent spectra of FAM-DNA1 in different conditions a：5 mmol/L FAM-DNA1；b：a+5 mmol/L c-DNA；c：b+10 U/mL OGG1；d：b+60 U/mL OGG1

為進一步驗證體系熒光信號的升高是OGG1 剪切釋放FAM-DNA 片段所致，以1 條相同序列的FAMDNA2 作為空白對照，在其它條件不變的情況下，考察其加入OGG1前、后體系的熒光信號變化（如圖3）。結果表明，FAM-DNA2與c-DNA雜交后熒光信號同樣被猝滅，當加入OGG1 后熒光強度無明顯變化，說明雙鏈結構未被破壞，不能產生熒光恢復。原因在于該體系中沒有供OGG1 特異識別切除的oxoG，當加入OGG1 后，不會引起熒光信號的增強，進一步驗證了實驗原理是合理的。

圖3 不同條件下FAM-DNA2的熒光光譜Fig.3 Fluorescent spectra of FAM-DNA2 in different conditions a：5 mmol/L FAM-DNA2；b：a+5 mmol/L c-DNA；c：b+60 U/mL OGG1

2.3 實驗條件的優化

2.3.1 培育溫度的優化 由于酶的活性與溫度有密切關系，溫度太低會使酶不能發揮最佳性能，溫度過高會使酶失去活性。為得到最佳的培育溫度，考察了加入酶后反應體系溫度對熒光信號的影響。圖4 為加入OGG1后不同溫度時體系熒光強度的變化圖。由圖4 可知，當反應溫度在30 ～35 ℃時，體系的熒光強度變化不明顯，當溫度達40 ℃時，體系的熒光強度變化明顯增大，且繼續升溫時體系的熒光信號略有增加但變化不明顯。考慮到實驗效率，選擇培育溫度為40 ℃。

圖4 不同培育溫度對反應體系熒光強度的影響Fig.4 Effects of different incubation temperature on fluorescence intensity of the reaction system FAM/dsDNA1：5μmol/L；OGG1：40 U/mL

2.3.2 剪切時間的優化 剪切時間是一個非常重要的因素，影響著方法的靈敏度?？疾炝薋AM/dsDNA1 體系與OGG1充分作用所需的時間。圖5顯示了酶剪切時間對體系熒光強度的影響。結果顯示，在30 ～180 min 范圍內，隨著反應時間的延長，熒光強度差值不斷增加，當達到150 min 后，變化趨于平緩，ΔF達到一個平臺值，說明此時剪切反應已趨于完全。因此，實驗選擇最佳反應時間為150 min。

圖5 加入OGG1后剪切時間對體系熒光強度的影響Fig.5 Effect of shear time on fluorescence intensity of the reaction system after addition of OGG1 FAM/dsDNA1：5μmol/L；OGG1：40 U/mL

2.4 線性范圍與檢出限

在優化的實驗條件下，對方法靈敏度進行了評估。如上所述，當向FAM/dsDNA1 體系中加入OGG1 前后，體系的熒光強度發生改變，通過熒光強度的變化值實現對OGG1 的活性檢測。向FAM/dsDNA1 體系中加入不同濃度OGG1，對熒光信號進行測定（如圖6）。圖6A 顯示，隨著OGG1 濃度從2 U/mL 增至1 000 U/mL，體系的熒光強度逐漸增強，表明OGG1 濃度越高，越多的FAM/dsDNA1 中的oxoG 受損堿基被切除，釋放越多帶FAM 信號的DNA片段，熒光增強變化越顯著，說明熒光信號的增強高度依賴OGG1 的濃度。由圖6B 可知，OGG1 的濃度（C，U/mL）在0 ～60 U/mL 范圍內與體系熒光強度的變化值（ΔF）呈良好的線性關系，線性方程為：ΔF＝21.672 5C＋6.982 0，相關系數（r2）為0.993 2。根據3σ規則計算得到OGG1的檢出限為0.7 U/mL。

圖6 FAM/dsDNA1體系與不同濃度OGG1作用的熒光光譜（A），FAM/dsDNA1體系中加入不同濃度OGG1的線性曲線（B）Fig.6 Fluorescent spectra of FAM/dsDNA1 reaction system with different concentrations of OGG1（A），and linear curves of concentrations of OGG1 versus fluorescence intensity changes of FAM/dsDNA1 reaction systems（B）a：5μmol/L FAM-DNA1；b：a+5μmol/L c-DNA；OGG1（c-k）：2，10，20，40，60，80，100，500，1 000 U/mL

2.5 選擇性

選擇性是衡量檢測方法優劣的重要指標，實驗考察了其他蛋白質對FAM/dsDNA1 熒光信號的影響。以UDG酶和RNase A 作為干擾酶，將UDG酶、RNase A 和OGG1分別加入到FAM/dsDNA1 反應體系中，在FAM/dsDNA1為5 μmol/L，RNase A 為100 μg/mL，UDG 為100 U/mL，OGG1為40 U/mL條件下，檢測相應的熒光強度變化。

結果顯示，RNase A 和UDG 體系的熒光信號變化（ΔF）很小，而在OGG1 存在情況下，熒光強度變化很大，說明本方法可以高特異性地區分OGG1 與其他干擾蛋白，對OGG1檢測有較好的選擇性，在生物醫學應用中具有很大的潛力。

2.6 抑制劑分析

Cd2+對許多酶存在抑制作用，常被選作酶抑制劑分析模型［13］。為研究OGG1抑制劑對OGG1酶活性的影響，選擇硝酸鎘Cd（NO3）2為抑制劑模型。OGG1的活性位點是通過Zn2+結合位點形成［14］，而Cd2+能夠占據該活性位點使得OGG1 活性被抑制［15］。在FAM/dsDNA1 為5 μmol/L，OGG1 為60 U/mL 條件下，將5、10、20、30、50、80μmol/L的Cd2+與OGG1在40 ℃下培育20 min，然后加入到FAM/dsDNA1體系進行熒光強度檢測。

基于公式（1）確定OGG1 被抑制的相對活性（RA）。根據RA與Cd2+濃度擬合的曲線確定最大半抑制濃度（IC50）。

RA=（Fi-F0）/（FCd-F0） （1）

其中，Fi為不存在Cd2+時的熒光強度；FCd為存在Cd2+時的熒光強度。結果表明，當Cd2+濃度從0 增至80μmol/L 時，OGG1的相對活性逐漸降低。根據擬合曲線確定在60 U/mL OGG1體系中，Cd2+抑制作用的IC50為22.26μmol/L。說明本方法可用于對OGG1酶活性的抑制作用研究。

2.7 血清樣品中OGG1活性分析

采用本方法檢測了正常人血清中OGG1的濃度。將血液樣品在3 000 r/min下離心5 min，上層淡黃色液體即為待測的血清樣品，-4 ℃冷藏備用。采用標準加入法，將不同濃度的OGG1加入正常人血清樣品中，測定OGG1 的回收率。結果如表2 所示，OGG1 的回收率為99.1%～105%，相對標準偏差（RSD）為1.0%～4.3%。表明本方法可用于實際樣品中OGG1的定量分析，在臨床診斷中具有很大的應用潛力。

表2 人血清樣品添加OGG1的回收率與相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of human serum samples added OGG1

3 結 論

本文基于脫氧鳥苷G 堿基的猝滅，設計了一種簡單、靈敏的熒光方法用于DNA 糖基化酶OGG1 的檢測。該方法具有明顯的優勢：探針設計簡單，避免探針的復雜合成；其識別響應原理是高效的PET機制，且利用鳥嘌呤天然高效的熒光猝滅能力，無需使用有機染料分子標記的DNA 或額外的納米材料作為猝滅劑，簡化了實驗步驟，節約了實驗成本。方法不僅能提高OGG1 活性的分析效率，而且可為DNA損傷相關修復酶的檢測提供簡便、通用的傳感平臺，有望實現對腫瘤細胞中OGG1活性的檢測。