UPLC-ESI-Q-TOF MS結合裂解規律分析姜科植物中二苯基庚烷類成分

胡雪雨，王彥志，2*，宋志敏，劉煜飛，劉雙晶，馮衛生*

（1.河南中醫藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450046）

二苯基庚烷是一類具有1，7-二取代苯基并以庚烷骨架為母體結構的化合物，可分為線性二苯基庚烷類和環狀二苯基庚烷類化合物［1］。其主要藥理活性有抗氧化、抗炎、抗病毒、細胞毒性、抗菌等［2-8］，主要存在于姜科植物（如生姜、高良姜、草豆蔻、草果、益智仁）中，是大多數姜科植物的主要活性成分［9-11］。姜皮，別名生姜衣，為姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的干燥根莖外皮［12］，在秋季挖取姜的根莖后洗凈并刮取外皮曬干即得，現行中國藥典尚未收載，但部分地方中藥飲片有收載［13］。姜皮味辛性涼，歸于脾、肺經，可起到發汗解表和行水消腫等作用［1］。草果，味辛性溫、無毒，為姜科豆蔻屬植物草果（Amomum tsao-ko）的干燥成熟果實［14］，具有燥濕健脾、祛痰截瘧之功效，主治痰飲胸滿、心腹疼痛、脾虛泄瀉、瘧疾等證［15］。益智仁是姜科山姜屬植物益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）的干燥成熟果實［16］，是“四大南藥”之一［17］，性溫，歸脾、腎經，可暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾［18］。目前，關于二苯基庚烷類化合物的研究多集中于姜和高良姜［19-20］，由于缺少標準品，只能依據質譜推測的化合物結構，推斷此類成分的質譜裂解規律，故缺乏足夠的準確性。

本研究采用具有高分辨率和高準確性的電噴霧-四極桿-飛行時間質譜（ESI-Q-TOF MS），對11 個不同類型二苯基庚烷類化合物標準品的電噴霧質譜碎片離子進行全面解析，推測可能的裂解途徑，總結二苯基庚烷類化合物的裂解規律，完善了此類化合物的質譜鑒定方法。并根據裂解途徑，采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間串聯質譜（UPLC-ESI-Q-TOF MS）對姜科植物來源中藥姜皮、草果、益智仁中的二苯基庚烷類成分進行鑒定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

UPLC-Triple TOF 6600 型超高效液相色譜-電噴霧-飛行時間高分辨質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；BSA224S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；5424R 型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 材料與試劑

（3R，5S）3，5-二羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-7-（3，4-二羥基苯基）庚烷（標準品1）、（3R，5R）3-乙酰氧基-5-羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-7-（3，4-二羥基苯基）庚烷（標準品2）、（3R，5S）3，5-二羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標準品3）、（3R，5R）3-乙酰氧基-5-羥基-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標準品4）、3，5-二乙酰氧基-1，7-雙（3，4-二羥基苯基）庚烷（標準品5）、3，5-二羥基-1，7-雙（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）庚烷（標準品6）、（3R）3-羥基-1，7-雙（3，4-二羥基苯基）庚烷（標準品7）、1，7-雙（4-羥基-3-甲氧基苯基）-5-甲氧基-3-庚酮（標準品8）、（1S，5S，3R）1，5-環氧-3-羥基-1-（4，5-二羥基-3-甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標準品9）、（1S，5S，3S）1，5-環氧-3-羥基-1-（4，5-二羥基-3-甲氧基苯基）-7-（4，3-二羥基苯基）庚烷（標準品10）、（1S，5S，3R）1，5-環氧-3-羥基-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標準品11）（純度＞95%）。11 個標準品對應的4 種二苯基庚烷結構類型示于圖1，各化合物的結構信息示于表1。甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司）。實驗用水為蒸餾水（中國屈臣氏公司）。

表1 11種二苯基庚烷的化學結構Table 1 Chemical structures of diarylheptanoids

圖1 4種二苯基庚烷的結構骨架類型Fig.1 Structural skeleton types of 4 diarylheptanoids skeleton R1-R8 were shown in Table 1

姜皮、草果購于云南省曲靖市紅河縣，益智仁購自海南省瓊中市，經河南中醫藥大學陳隨清教授鑒定分別為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc. 的根莖外皮，以及姜科植物草果Amomum tsaokoCrevost et Lemarie 和益智Alpinia oxyphyllaMiq. 的干燥成熟果實。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm），柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL·min-1，進樣量：2 μL，流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈。姜皮成分的洗脫梯度：0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5%～15%B；4.0～24 min，15%～70%B；24～25 min，70%～90%B；25～27 min，90%B；27～28.1 min，90%～5% B；28.1～30 min，5% B。草果和益智仁成分的洗脫梯度：0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5%～40% B；4.0～23 min，40%～90% B；23～27 min，90% B；27～28 min，90%～5%B；28～30 min，5%B。

1.4 質譜分析條件

ESI 電離源，正離子掃描，噴霧氣：310 264 Pa（45 psi），輔助加熱氣：344 738 Pa（50 psi），氣簾氣：241 316 Pa（35 psi），去簇電壓：80 V，源溫度：550 ℃，一級質譜掃描范圍：m/z100～1 000，二級質譜掃描范圍：m/z50～1 000，碰撞電壓：（40±20）V。

標準品采用針泵注射獲得質譜數據，注射泵進樣速度：10μL/min。

1.5 樣品處理

1.5.1 標準品制備 分別精密稱取各標準品1 mg于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，備用。

1.5.2 供試品制備 姜皮用10 倍量50%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，濾除藥渣后將提取液濃縮干燥得浸膏。用適量50%甲醇溶解，過0.22μm 微孔濾膜，離心（12 000 r/min，15 min），取上清液備用。草果和益智仁分別用10倍量75%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，濾除藥渣后將提取液濃縮，再用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮干燥得浸膏，用適量70%甲醇水溶液溶解，過0.22μm 微孔濾膜，離心（12 000 r/min，15 min），取上清液備用。

實驗前，分別使用對應的校正液對正離子模式進行校正。使用進樣針分別吸取約200μL 標準溶液，在正離子模式下進樣分析。

2 結果與討論

2.1 正離子模式下二苯基庚烷類化合物的裂解規律

在正離子模式下，本實驗能夠得到各化合物清晰的二級質譜圖，及其質譜信息（表2）。各標準品的精確質荷比與理論質荷比相吻合，質譜碎片信息全面、穩定。

表2 11個二苯基庚烷的質譜信息Table 2 Mass spectrometric informations of diarylheptanoids

2.1.1 Ⅰ類二苯基庚烷類化合物的裂解規律 根據Ⅰ類二苯基庚烷類化合物標準品的碎片特征綜合推斷，此類化合物主要有兩條裂解途徑。

圖2A 為標準品4的二級質譜圖，由圖推測，化合物首先丟失碳鏈上的取代基—OH、—OCOCH3產生碎片m/z371，一條裂解途徑是C7位上的苯環及其取代基丟失，產生碎片m/z247，然后從C7到C2依次丟失1 個C，產生碎片m/z233、m/z221、m/z207，以及主要特征碎片m/z193、m/z167。另一條裂解途徑是C1位上的苯環及其取代基丟失，產生碎片m/z217，然后丟失CH2，產生碎片m/z203，隨后分別丟失C2H4、CH2，依次產生碎片m/z175、m/z161；m/z203還可丟失C2H2產生碎片m/z177，碎片m/z177丟失1 個CH2或C3H4，分別產生碎片m/z163 和主要特征碎片m/z137，碎片m/z163 脫水，產生碎片m/z145，隨后丟失1 個CH2，產生碎片m/z131。標準品4 可能的裂解途徑見圖3。通過對標準品1、2、3、5、6的二級碎片離子進行全面解析，推測其裂解途徑與標準品4基本一致。

圖2 二苯基庚烷標準品（4、7、8、10）的二級質譜圖Fig.2 ESI-MS/MS spectra of diarylheptanoid standards（4，7，8，10）A. standard 4；B. standard 7；C. standard 8；D. standard 10

2.1.2 Ⅱ類二苯基庚烷類化合物的裂解規律 Ⅱ類二苯基庚烷類化合物的裂解途徑與Ⅰ類相似，差別在于，碳鏈在裂解過程中只出現1 個雙鍵(2 個苯環都丟失的情況除外)。根據標準品7 的二級質譜圖(圖2B)推測，在正離子模式下，化合物首先丟失碳鏈上的取代基—OH，產生碎片m/z315，然后丟失C6H6O2產生碎片m/z205，進一步丟失C3H6產生碎片m/z163，進而丟失CH2產生碎片m/z149，碎片m/z149 丟失C2H2形成主要特征碎片m/z123，或者脫水形成碎片m/z131，碎片m/z163還可脫水形成碎片m/z145，然后丟失CH2形成碎片m/z131。其可能的裂解途徑見圖4。

圖4 標準品7可能的裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of standard 7

2.1.3 Ⅲ類二苯基庚烷類化合物的裂解規律 通過對Ⅲ類標準品的質譜數據進行分析，推測該類化合物主要有兩條裂解途徑。根據標準品8的二級質譜圖（圖2C）推測，一條裂解途徑是C3—C4鍵斷裂產生碎片m/z179，進一步丟失O，產生碎片m/z163，隨后丟失C2H2，產生主要特征碎片m/z137。另一條途徑是C2—C3鍵斷裂，產生碎片m/z207，進一步丟失CH2O產生碎片m/z177，然后丟失C3H4，產生主要特征碎片m/z137，碎片m/z177還可丟失CH4O產生碎片m/z145，進一步丟失CH2產生碎片m/z131。其可能的裂解途徑見圖5。

圖5 標準品8可能的裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of standard 8

2.1.4 Ⅳ類二苯基庚烷類化合物的裂解規律 不同于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類線性二苯基庚烷，Ⅳ類二苯基庚烷是環狀二苯基庚烷。

根據標準品10的二級質譜圖（圖2D），推測該類化合物有兩條裂解途徑，一條途徑是C5—C6鍵斷裂，產生碎片m/z237，再丟失CH2產生碎片m/z223，進一步丟失C2H4O產生主要特征碎片m/z179，碎片m/z179分別丟失C2H2、CH4O，產生主要特征碎片m/z153和m/z147，其中m/z147可丟失CO產生碎片m/z119。另一條途徑是含氧環斷裂產生碎片m/z165，然后丟失C2H2O產生主要特征碎片m/z123。通過對標準品9、11的二級碎片離子進行綜合分析，推測其裂解途徑與標準品10基本一致。標準品10可能的裂解途徑見圖6。

圖6 標準品10可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of standard 10

2.2 3種姜科植物中二苯基庚烷類化合物的鑒定

利用UPLC-ESI-Q-TOF MS 獲得姜皮、草果、益智仁的質譜信息，結合裂解規律，分別鑒定出14、11、10個二苯基庚烷類化合物（見表3），其詳細鑒定過程以化合物9、11為例進行闡述。

表3 二苯基庚烷的鑒定結果Table 3 Identification results of diarylheptanoids

（續表3）

化合物9的［M+H］+為m/z405.191 1，元素組成分析顯示其分子式為C22H28O7。其二級質譜圖與標準品9相似，推測為Ⅳ類二苯基庚烷類化合物，特征碎片離子m/z193.086 0、m/z167.070 2與標準品9的m/z179.071 0、m/z153.054 9相比分別增加14.015 0、14.015 3，結合裂解規律以及文獻［21］推測化合物9為1，5-環氧-3-羥基-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷。

化合物11 的［M+H］+為m/z435.201 2，分子式為C23H30O8。其二級質譜圖與標準品4 相似，推測為Ⅰ類二苯基庚烷類化合物，特征碎片離子m/z179.069 8、m/z153.054 5 與標準品4 的m/z193.086 6、m/z167.071 0 相比分別減少14.016 8、14.016 5，結合裂解規律以及文獻［22］推測化合物11 為3-乙酰氧基-5-羥基-1-（3-甲氧基-5，4-二羥基苯基）-7-（3-甲氧基4-羥基苯基）庚烷。

在3 類藥材中，檢出最多的二苯基庚烷類型是Ⅰ類，其次是Ⅳ類。姜皮和草果中Ⅰ類的二苯基庚

烷較多，而益智仁中Ⅲ類的二苯基庚烷相對較多。由峰面積比（Area ratio=化合物峰面積/各自藥材中的1，5-環氧-3-羥基-1-（3，4-二羥基-5-甲氧基苯基）-7-（4-羥基苯基）庚烷的峰面積×100%）可看出，Ⅲ類二苯基庚烷的響應值在3種藥材中普遍較高。

3 結 論

本文采用ESI-Q-TOF MS 對11 種二苯基庚烷類化合物標準品的質譜裂解規律進行研究，發現各類二苯基庚烷在正離子模式下主要有兩種裂解途徑，C1或C7與苯環及其取代基會形成主要特征碎片，根據質譜圖的主要碎片峰推測苯環上的取代基，比如m/z107、m/z123、m/z137、m/z153、m/z167 分別提示苯環上的取代基為1 個羥基、2 個羥基、1 個羥基和1 個甲氧基、2 個羥基和1 個甲氧基、1 個羥基和2 個甲氧基。對于線性二苯基庚烷（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類），若碳鏈上無羰基，在正離子模式下首先丟失碳鏈上的取代基，隨后主要有兩條裂解途徑，一條是C7位上的苯環丟失，然后從C7到C2依次丟失；另一條是C1位上的苯環丟失，然后從C1到C6依次丟失，但當苯環上有2 個及以上取代基時，可能會出現更多的裂解途徑。若碳鏈上有羰基，由于羰基的存在，這類二苯基庚烷多為羰基左右的碳鍵發生斷裂，由此產生2 條主要裂解途徑，首先丟失O，然后依次丟失其他基團。對于環狀二苯基庚烷（Ⅳ類），含氧環附近發生碳鍵裂解，產生2 條主要裂解途徑，此外，該類二苯基庚烷除了C1或C7與苯環及其取代基會形成主要特征碎片外，還會出現C1～C3與苯環及其取代基所形成的主要特征碎片，如m/z179。依據本研究總結的二苯基庚烷類化合物的質譜裂解規律，從姜皮、草果、益智仁中分別鑒定出14、11、10 個二苯基庚烷類成分，為姜科植物中該類化合物的快速定性分析提供了理論基礎。