microRNA-214靶向調控HOXB7基因抑制結直腸癌細胞侵襲轉移的機制與意義

劉 英 何鳳屏▲ 劉玉蘭 李定云

1.汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院體檢中心，廣東韶關 512026；2.汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院檢驗科，廣東韶關 512026；3.汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院胃腸外科，廣東韶關 512026

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）為全球常見的三大惡性腫瘤之一，其死亡率排第三位。隨著我國人民的生活節奏加快以及飲食結構改變，其發病率與病死率均持續升高，而且有年輕化的趨勢，嚴重威脅著人類的健康。CRC 的病因尚未明確，其發病機理極其復雜、涉及到多階段、多步驟、多基因改變的過程。目前國內外對CRC 的早期診斷仍處于較低水平，約半數的患者在明確診斷時已進入中期和晚期。因此，對CRC 發生發展及轉移機制進行深入研究，尋找預防和治療的有效途徑，是目前國內外研究的熱點，也是亟待解決的關鍵問題。本研究認為，microRNA-214（miRNA-214）上調導致HOXB7 基因下調，可能就是抑制CRC 細胞生長、侵襲、轉移的關鍵所在點，為此進一步把Wnt/β-catenin 信號轉導通路納入研究范疇，分析其作用機制，旨在為CRC 轉移的早期診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院收治的200 例CRC 住院患者為研究對象，按照是否發生轉移分為無轉移組（100 例）和轉移組（100 例），另選取同期健康體檢者200 例為對照組。無轉移組中，男68 例，女32 例；年齡23～65歲，平均（57.91±5.36）歲。轉移組中，男71 例，女29 例；年齡23～66 歲，平均（58.01±5.40）歲；肝轉移47 例，淋巴結轉移53 例。對照組中，男115 例，女85 例；年齡21～64 歲，平均（56.39±5.24）歲。三組的性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已得到醫院倫理委員會審批（批準文號：YBAF-2018-012），所有受試者均已簽署知情同意書。

納入標準：①入選患者均為初次診治，首次接受抗腫瘤治療（包括放療、化療、免疫治療等）；②臨床病理資料完整。排除標準：①合并有急性感染性疾病；②合并嚴重的心肝腎肺等器官功能不全；③患者拒絕接受檢查；④經研究者判斷患者不適合參加本研究；⑤標本不合格，不能進行檢測的樣本；⑥臨床數據缺失或記錄不規范樣本。

1.2 方法

①收集血漿標本，所有研究對象均在清晨7:30 am，空腹抽取靜脈血檢測常規腫瘤標志物，同時抽取5 ml 靜脈血置于EDTA 試管中，立即送到實驗室提取DNA 或RNA，并放置于-80℃冰箱中保存備檢。②利用人CRC 細胞SW480、SW1116（上海慧穎生物科技有限公司）進行實驗；③采用實時熒光定量PCR技術分別檢測miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的mRNA 的表達，并作相關性分析。檢測miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的引物和探針由上海生物工程技術服務有限公司提供，在BIO-RAD CFX96 實時熒光定量PCR 儀上進行熒光擴增和檢測其相對表達量。④采用miRanda、PicTar 和Tar-getScan 數據庫預測miRNA-214 的靶基因。⑤利用基因敲除和轉染技術驗證miRNA-214 通過靶向HOXB7 基因調控Wnt/β-catenin 的表達的作用機制。⑥將miRNA-214 模擬物和重組有HOXB7 基因3' UTR 區miRNA-214 潛在結合位點的野生型和突變型的熒光素酶報告基因分別轉染到CRC 細胞系SW1116 和SW480 細胞，并檢測HOXB7 mRNA 和蛋白水平，為了進一步研究miRNA-214 和HOXB7 之間的直接結合和抑制作用，24 h 后檢測熒光素酶活性，對HOXB7-wt-3' UTR 及其突變體型（FGFR1-mt-3' UTR）進行擴增和克隆pGL3 中熒光素酶報告基因，進一步驗證miRNA-214對HOXB7 基因的直接靶向調控促進CRC 細胞侵襲和轉移的能力。

觀察三組中miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin的表達，分析三者的聯系，并且分析對CRC 細胞生長和遷移的影響。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 三組miRNA-214 表達情況的比較

轉移組和無轉移組的miRNA-214 表達量分別為（1.23±0.34）和（2.05±1.19），均低于對照組的（5.94±1.84）（t值=27.69，P值＜0.05；t值=21.51，P值＜0.05），且轉移組低于無轉移組，差異有統計學意義 （t=21.51，P＜0.05）（圖1）。

圖1 三組miRNA-214 表達情況的比較

2.2 miRNA-214 在CRC SW1116、SW480 細胞株中的表達情況

miRNA-214 在CRC SW1116 細胞株中的表達量為（3.57±1.89），低于對照組的（6.13±2.17），差異有統計學意義（t=24.31，P＜0.05）；miRNA-214 在SW480 細胞株中的表達量為（2.86±1.74），低于對照組的（5.58±2.03）（t=23.78，P＜0.05）（圖2～3）。

圖2 miRNA-214 在CRC SW1116 細胞株中的表達量

圖3 miRNA-214 在CRC SW480 細胞株中的表達量

2.3 miRNA-214 對HOXB7 基因、CRC 細胞生長和遷移的影響

首先評估FGFR1 敲除是否可以模擬miRNA-214過度表達的效果，用si RNA 轉染SW1116 細胞獲得HOXB7；Western 印跡分析證實HOXB7 表達減少（圖4A）。用miRNA-214 模擬物轉染SW1116 和SW480細胞，并且檢測HOXB7 mRNA 和蛋白水平，研究結果表明，在SW1116 和SW480 細胞生長和轉移的過程中，miRNA-214 呈高表達，HOXB7 呈低表達。與對照組比較，轉染si-HOXB7 的SW1116 和SW480 細胞顯示減少細胞集落形成 （P＜0.05）（圖4B），其效應與miRNA-214 過表達相似。

圖4 Western blot 檢測miRNA-214、HOXB7、si-HOXB7 的表達

2.4 HOXB7 在CRC 組織和細胞株中的表達

與對照組比較，HOXB7 在SW1116 和SW480 細胞株中呈高表達水平（圖5A），HOXB7 在CRC 無轉移組和CRC 轉移組呈現高表達水平（圖5B）。

圖5 HOXB7 在CRC 組織和細胞株中的表達

2.5 miRNA-214 與HOXB7 表達的相關性分析

數據庫預測結果表明，HOXB7 具有良好的生物活性，miRNA-214 潛在的結合位點在3' UTR 區域中（圖6A）。miRNA-214 模擬物轉染結果表明，HOXB7表達受miRNA-214 負調控（圖6B、C）。實時熒光定量PCR 檢測結果顯示，在CRC 患者組織和CRC SW1116 細胞中，miRNA-214 與TOXB7的表達水平呈負相關（r=-0.394，P＜0.01）（圖6D）。

圖6 HOXB7 表達及其與miRNA-214 的相關性分析

2.6 miRNA-214 與HOXB7 熒光酶活性的相關性分析

在共轉染的細胞中，與陰性對照細胞和空白細胞相 比，pcDNAmiRNA-214 在SW1116 和SW480 細 胞中的HOXB7-wt-3' UTR 熒光素酶活性降低（P＜0.05）（圖7A），且在HOXB7-mt-3' UTR 和pcDNAmiRNA-214 之間沒有發現熒光素酶活性的差異（圖7B）。

圖7 分析miRNA-214 與HOXB7 熒光酶活性的表達

2.7 miRNA-214 模擬物對HOXB7 表達的影響

miRNA-214 模擬物降低了SW1116、SW480 細胞中HOXB7 的表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 miRNA-214 模擬物對HOXB7 表達的影響

2.8 HOXB7 表達對Wnt/β-catenin 表達的影響

采用免疫熒光染色技術檢測CRC SW1116 細胞發現，當HOXB7 過表達后，Wnt/β-catenin 表達也增高；而在加入miRNA-214 干擾HOXB7 后，Wnt/βcatenin 表達明顯下降（圖8）。

圖8 HOXB7 表達對Wnt/β-catenin 表達的影響

3 討論

CRC 為最常見的惡性腫瘤之一，早期無明顯癥狀，容易發生轉移，大部分患者在明確診斷時就發生轉移了。近年來的研究發現，50%的原發性CRC 患者同時伴有肝轉移，而且部分病人在接受原發腫瘤手術切除和輔助化療后仍出現肝轉移。其預后與診斷時機密切相關，這導致預后差和病死率高的重要因素，可見侵襲和轉移是造成CRC 患者死亡的首要原因。

腫瘤細胞發生-發展-侵襲-轉移的過程是腫瘤細胞與宿主細胞之間相互作用的連續動態過程，這個過程是復雜的、多步驟的，多種細胞組分、相關基因以及標志性分子參與，并形成復雜的相互作用網絡。miRNA 是一種具備調控功能的小分子RNA，miRNA-214 在多種惡性腫瘤中低表達，而在癌旁正常組織中高表達，提示其可能具有抑制基因的特性。近年來研究發現，miRNA-214 與多種惡性腫瘤相關，可通過多種信號轉導途徑發揮抑癌和促癌作用。miRNA-214 在CRC 中表達下調，參與了CRC 的發生和發展，在癌細胞增殖過程中miRNA-214 可能直接或間接調控某些蛋白mRNA 3'UTR 區，使蛋白合成抑制減少，使細胞周期與細胞增殖活性失調而發生惡性轉化。HOXB7 基因屬同源異型盒基因HoxB 家族，是一種很重要的轉錄調控因子，在正常組織中幾乎不表達。HOXB7 基因的異常表達被國外學者證實與腫瘤的臨床惡性程度和不良預后有密切相關。本實驗研究的核心指標HOXB7 基因最初是在研究腫瘤新生血管生成過程中被發現的，它可以通過調節腫瘤細胞分泌相關細胞因子促進腫瘤轉移，推測其與腫瘤的血管生成有關。Wnt 為一種分泌型糖蛋白，導致β-catenin 積累。β-catenin 即β-連環蛋白，游離的β-catenin 進入細胞核，可以調節基因表達，其異常表達或激活能引起腫瘤。Wnt 信號通路為一種復雜的蛋白質作用網絡，最常見于胚胎發育及惡性腫瘤，而即Wnt/β-catenin 是經典的Wnt 信號通路，可激活核內靶基因的表達。

本研究結果顯示，miRNA-214 在CRC 轉移和CRC 無轉移患者組織中的表達量分別為（1.23±0.34）和（2.05±1.19），低于在結直腸切緣無瘤黏膜組織中的表達量；miRNA-214 在CRC SW1116 和SW480 細胞株中的表達量均低于在正常細胞株中的表達量（P ＜0.05）。用miRNA-214模擬物轉染SW1116 和SW480 細胞發現，在SW1116 和SW480細胞生長和轉移的過程中，miRNA-214 高表達抑制了HOXB7 的表達，降低了HOXB7 mRNA 和蛋白水平。研究結果提示，在大腸癌細胞系中，HOXB7 是miRNA-214 的靶基因，兩者之間的表達水平呈負相關（r=-0.394，P＜0.01），miRNA-214 低水平表達激活HOXB7 基因，并促進CRC 細胞生長和遷移，而miRNA-214 高表達會抑制HOXB7 基因，進而抑制CRC 細胞生長和遷移。HOXB7敲除可以達到模擬miRNA-214 高表達的效果，沉默HOXB7 顯示，miRNA-214 高表達會抑制CRC 細胞侵襲和遷移。而且HOXB7 在CRC 無轉移和CRC 轉移患者呈現高表達水平，在SW1116 和SW480 細胞株中也呈高表達水平，CRC 發生轉移的患者血清中HOXB7 的濃度高于未發生轉移的患者，表明HOXB7基因與CRC 發生發展密切相關。HOXB7 基因表達上調，既提高了CRC 細胞的運動和侵襲能力，又激活免疫系統的巨噬細胞，提示HOXB7 基因可能是腫瘤細胞激活和利用自身免疫系統的重要樞紐。實驗研究采用免疫熒光染色技術，檢測CRC SW1116 細胞中HOXB7 過表達后的Wnt/β-catenin 表達情況，結果發現，當HOXB7 過表達后，Wnt/β-catenin 表達也增高；當加入miRNA-214 干 擾HOXB7 后，Wnt/β-catenin表達明顯下降，提示HOXB7 通過Wnt/β-catenin 通路發生作用。

因此，本研究認為miRNA-214 就是一個新的抑癌因子，miRNA-214 上調導致HOXB7 基因下調可能就是抑制CRC 細胞生長、侵襲、轉移的關鍵所在點，這提示miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作為未來潛在的CRC 抗癌細胞侵襲和轉移療法的新靶點。本項目從多個方面和多個層次研究miRNA-214 靶向HOXB7 基因調控Wnt/β-catenin 通路，闡明該通路參與抑制CRC 侵襲和轉移的分子機制，這為早期輔助診斷CRC 提供了新的檢測手段。總結來看，本項目的創新點在于，首次提出miRNA-214靶向HOXB7 基因調控抑制CRC 細胞生長、 侵襲、遷移的分子機制，首次提出miRNA-214 的表達調控Wnt/β-catenin 信號通路發揮抑制CRC 細胞侵襲和轉移的作用機制。本項目的研究一方面提示了miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作為未來潛在的CRC 抗癌細胞侵襲和轉移療法的新靶點，另一方面也可以作為臨床診斷和預后評價的新分子標志物，這為CRC 診斷和治療提供了新的靶點。因此，本項目的研究具有較大的臨床價值和科學意義。