高效液相色譜法測定保健品葡萄籽膠囊中咖啡因的不確定度評定

鄭海蓉，蔡良平，付小蓉，曹春梅，陳 翠，黎小蘭，劉光蘭

（湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040）

1 概論

咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，提煉自茶葉、咖啡果等的成分。對于人的精神有興奮作用，是一種中樞神經(jīng)興奮劑[1]，攝入后可以達到驅(qū)除睡意、恢復精力的效果[2-4]。近年來，添加了咖啡因的茶葉、咖啡、能量飲料等飲品在人群中十分受歡迎[5-6]，上班族尤甚，由于具有成癮性，長期大量服用咖啡因會傷害人的身體，在停用后會出現(xiàn)戒斷癥狀，如精神不振、渾身無力等[7-9]，國家對于咖啡類飲料、能量膠等的咖啡因規(guī)定了限量指標[10-11]，而咖啡因也被列入國家管制的精神類藥品。

目前，咖啡因的檢測方法主要有高效液相色譜法、超高效液相色譜法、紫外分光光度法[12-18]，使用高效液相色譜法，即國標GB/T 5009.197—2003[19]中咖啡因的含量測定方法，根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[20]中提到的不確定度評定[21-22]程序，并參考JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[23]中用到的玻璃儀器的不確定度等，對測定樣品葡萄籽膠囊中咖啡因含量時涉及到各分量帶來的不確定度進行評估，以便參考試驗結(jié)果的不確定度，在日后開展日常試驗時加以注意。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

咖啡因?qū)φ掌罚ㄙ|(zhì)量濃度為500 μg/mL，擴展不確定度為1%） （批號：GBW(E)100174），北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司提供；葡萄籽膠囊（批號19390），湯臣倍健股份有限公司提供；1- 庚烷磺酸鈉（離子對試劑）、甲醇（色譜純），上海安譜實驗科技股份有限公司提供；磷酸（分析純），廣東廣試試劑科技有限公司提供；乙腈（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰咎峁?/p>

2.2 儀器與設備

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配VWD）；C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） （菲羅門），P180H 超聲波清洗器，德國Elma 產(chǎn)品。

2.3 試驗方法

2.3.1 儀器條件

流動相：混合溶液1- 癸烷磺酸鈉溶液（1.22 g-850 mL） +乙腈+磷酸=850+150+1；流速1.0 mL/min；色譜柱：C18，柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm；柱溫30 ℃，進樣量2 μL。

2.3.2 標準溶液配制

精確量取咖啡因?qū)φ掌?.00 mL 于25 mL 棕色容量瓶中，溶于甲醇+水+磷酸=100+400+0.5 混合溶液中并定容至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL。

2.3.3 供試品溶液配制

取20 粒以上片劑或膠囊試樣研磨或混勻，稱取一定量試樣于試管中，加入甲醇+ 水+ 磷酸=100+400+0.5 混合溶液50 mL，超聲振蕩提取5 min后，離心沉淀雜質(zhì)，用0.45 μm 的有機相濾膜過濾其上清液，即得樣品溶液。

2.3.4 計算公式

所選樣品葡萄籽中咖啡因含量的計算如下：

式中：X——樣品中咖啡因的含量，mg/g；

C——樣品溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品溶液定容體積，mL；

K——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)，K=1；

m——稱取葡萄籽樣品的質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度的來源分析

咖啡因試樣含量測定的不確定度來源見圖1。

根據(jù)整個試驗過程及圖1 所示的不確定度來源分析，主要有以下幾個不確定度來源。

圖1 咖啡因試樣含量測定的不確定度來源

試樣重復測定時，重復性引起的不確定度ur(X1)。

標準品量取及稀釋配制溶液引起的標準不確定度ur(X2)。

樣品稱量及樣品溶液配制引起的標準不確定度ur(X3)。

儀器（高效液相色譜儀） 引起的標準不確定度ur(X4)。

標準曲線擬合引起的標準不確定度ur(X5)。

3.2 不確定度傳播律

根據(jù)不確定度的測量模型計算公式，使用以下公式計算合成相對不確定度：

3.3 不確定度各分量評估

3.3.1 測量重復性引入的不確定度ur(X1)

按照GB/T 5009.197—2003 對所選定值樣品的咖啡因含量平行測定12 次，得到表1 中的數(shù)據(jù)。該測定產(chǎn)生的不確定度屬于A 類不確定度，采用A 類評定方式。

葡萄籽膠囊（澳洲進口） 樣品中咖啡因的含量重復測定12 次結(jié)果見表1。

表1 葡萄籽膠囊（澳洲進口） 樣品中咖啡因的含量重復測定12 次結(jié)果/mg·g-1

按貝賽爾公式計算出試驗標準偏差為：

在日常檢驗中，該樣品中咖啡因含量重復測定2 次時，其測量結(jié)果為2 次結(jié)果的算術(shù)平均值，故由樣品重復測定而引起的標準不確定度為：

3.3.2 標準物質(zhì)引起的標準不確定度分量ur(X2)

3.3.2.1 標準物質(zhì)含量引入的不確定度ur（X3.3.2.1）

查詢咖啡因的標準物質(zhì)證書，得知該標準溶液的質(zhì)量濃度為500 μg/mL，擴展不確定度為1%，k=2，則有：

相對標準不確定度：ur（X3.3.2.1）=1%×500 μg/mL/2/500 μg/mL=0.005.

3.3.2.2 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度ur（X3.3.2.2）

用1 mL 刻度移液管進行量取，咖啡因標準物質(zhì)體積v=1.00 mL；1 mL 刻度移液管（A 級） 的最大的允許誤差為±0.001 g，按矩形分布，包含因子k為則有：

3.3.2.3 標準溶液稀釋和定容過程引起的不確定度ur（X3.3.2.3）

溶液定容過程引起的不確定度主要由25 mL 單標線容量瓶（A 級） 和室溫對液體體積的影響引入的不確定度。

3.3.2.3.1 25 mL 單標線容量瓶校準產(chǎn)生的標準不確定度ur（X3.3.2.3.1）

對照配制時玻璃器具校準引入的不確定度見表2。

表2 對照配制時玻璃器具校準引入的不確定度

由表2 可知，試驗中所用的25 mL 單標線容量瓶都屬于A 級測量結(jié)果，最大允許誤差為±0.03 mL，按矩形分布，則有：

3.3.2.3.2 溶液溫度與校準溫度不同產(chǎn)生的標準不確定度ur（X3.3.2.3.2）

假設溶液與校準溫度的差異為±5 ℃，容量瓶的體積為25 mL，甲醇體積膨脹系數(shù)α 為(1.18×10-3)/℃，水體積膨脹系數(shù)α 為(2.1×10-4)/℃，磷酸的體積變化忽略不計，前述溶劑的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故僅考慮溶劑膨脹帶來的不確定度即可，根據(jù)最大允許誤差，按矩形分布，取則有：

25 mL 單標線容量瓶（A 級） 產(chǎn)生的合成相對標準不確定度：

綜上可得，咖啡因標準物質(zhì)引起的相對標準不確定度為：

3.3.3 咖啡因樣品引起的標準不確定度ur(X3)

3.3.3.1 樣品稱量引起的不確定度ur（X3.3.3.1）

稱取試樣重量m=0.1 g，查詢所用電子天平的校準證書，最大的允許誤差為±0.000 05 g，偏載測試最大的允許誤差為±0.001 g，屬正態(tài)分布，k=2，則有：

合成標準不確定度為：

3.3.3.2 樣品定容引起的不確定度ur（X3.3.3.2）

樣品溶液稀釋定容時帶來的不確定度主要由定容時用到的50mL 單標線容量瓶（A 級） 引入。

3.3.3.2.1 50 mL 單標線容量瓶校準產(chǎn)生的標準不確定度ur（X3.3.3.2.1）

樣品配制時玻璃器具校準引入的不確定度見表3。

表3 樣品配制時玻璃器具校準引入的不確定度

由表3 可知，試驗中所用的50 mL 單標線容量瓶都屬于A 級測量結(jié)果最大允許誤差為±0.05 mL，

3.3.3.2.2 溶液溫度與校準溫度不同產(chǎn)生的標準不確定度ur（X3.3.3.2.2）

假設溶液與校準溫度的差異為±5 ℃，容量瓶的體積為50 mL，甲醇體積膨脹系數(shù)α 為(1.18×10-3)/℃，水體積膨脹系數(shù)α 為(2.1×10-4)/℃，磷酸的體積變化忽略不計，前述溶劑的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故僅考慮溶劑膨脹帶來的不確定度即可，

標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

50 mL 單標線容量瓶（A 級） 產(chǎn)生的合成相對標準不確定度：

由上面分析可得，咖啡因樣品引起的相對標準不確定度為：

3.3.4 高效液相色譜儀引起的不確定度ur(X4)

高效液相色譜儀引入的不確定度分量評定ur（X3.3.4）。液相色譜儀峰面積積分處理最大誤差為±1%，k=2，樣品峰面積的平均值A 為236.927 09，則有：

標準不確定度為：

相對標準不確定度為：u（rX3.3.4）=u（rX3.3.4)/A=1%×236.927 09/2/236.927 09=0.005.

高效液相色譜儀引起的不確定度：

3.3.5 標準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分量評定ur（X5）

標準曲線數(shù)據(jù)見表4。

表4 標準曲線數(shù)據(jù)

可用以下公式計算質(zhì)量濃度x測量時由標準曲線帶來的變化的不確定：

式中：SR——工作曲線標準差；

b——工作曲線斜率；

p——樣品液測量的次數(shù)，12；

x——樣品測得平均質(zhì)量濃度，0.041 112 45，mg/mL；

n——標準液測量的次數(shù)，5；

xi——第i 次測量時標準液質(zhì)量濃度，mg/mL；

c——標準液平均質(zhì)量濃度，0.052 09 mg/mL；

a——工作曲線截距；

Ai——第i 次測量時標準液的峰面積；

由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度：

相對標準不確定度一覽表見表5。

表5 相對標準不確定度一覽表

3.4 合成相對標準不確定度評定

由表4 中各相對標準不確定度合成

各測量不確定度的統(tǒng)計直方圖見圖2。

圖2 各測量不確定度的統(tǒng)計直方圖

樣品測定的平均值為19.05 mg/g，則樣品中咖啡因測定的標準不確定度為：

ucr(X)=X×ur(X)=19.05×0.013 3=0.25 mg/g.

3.5 擴展不確定度

根據(jù)上步2.4 所得到的標準不確定度乘以包含因子即可得到樣品的擴展不確定度，取置信概率p=95%，k=2，則測量葡萄籽中咖啡因含量時擴展不確定度計算公式如下：此次測定的咖啡因樣品平均含量為19.05±0.50 mg/g。

4 結(jié)論

從圖2 可以看出，樣品中咖啡因含量的不確定度因素中，標準曲線擬合跟標準溶液配制帶來的不確定度最大，而樣品溶液的配制和高效液相色譜儀所帶來的不確定度最小，說明在日后檢驗咖啡因的含量時，應注重液相色譜儀的狀態(tài)和標準溶液的配制過程，具體體現(xiàn)在勤于維護高效液相色譜儀、定期檢查檢測器的紫外燈能量、儀器進樣時定量是否準確，以及定期校正高效液相色譜儀，進行期間核查；配置標準溶液時，移取標準溶液時選用高校準級別的移液管、高校準級別的容量瓶，并避免溫度波動過大對溶液體積帶來的影響，人員操作時應將檢測流程及注意事項充分掌握，以使檢測結(jié)果更準確。