貴定云霧貢茶中茶多糖提取工藝優化

姚 佳，陳開琴，余 鳳

（1. 黔南民族師范學院生物科學與農學院，貴州都勻 558000；2. 遵義師范學院生物與農業科技學院，貴州遵義 563006）

0 引言

云霧貢茶屬于綠茶，產于貴州黔南州省貴定縣境內，是都勻毛尖茶的主產地，以茶鮮葉為原料加工而制成，色澤嫩綠透黃，外形細緊彎曲，滿披白毫，在元代已成為朝廷貢茶，清朝被列為國內八大名茶之一。因云霧山位于烏、沅、盤三江之分水嶺，且山高且連綿、多峭壁、云霧彌漫，因其特殊的地形，茶葉品質佳。茶多糖（Tea polysaccharides，TPS）是茶葉中一種由糖類和蛋白質組成具有生理活性的多糖，具有多種保健功能，可治療糖尿病、腎病、癌癥等疾病[1-3]。近年來，為了提高茶葉的附加利用值，人們越來越重視對茶葉中功能成分的開發和利用，綠茶中的茶多酚和咖啡堿是集中開發比較多的成分，關于綠茶多糖的研究開發比較少，隨著綠茶保健功能不斷被揭示，綠茶多糖也受到學者們的關注，綠茶中的多糖根據茶葉品種，產地、采摘季節不同，茶葉中多糖含量各有不同。近年來，研究人員對綠茶中的多糖提取常用溶劑提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法等。為提高云霧貢茶的利用率，采用云霧貢茶中夏秋茶為研究對象，進行茶多糖的提取，以期為提高云霧貢茶的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云霧貢茶，購自貴定縣云霧茶廠。

CJ-G040 型超聲波提取器，深圳市超潔科技實業有限公司產品；FCR2002-UF-P 型超純水機，青島富勒姆科技有限公司產品；GXZ-9140MBE 型鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；HH-S6 型數顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品；CP214 型分析天平，奧豪斯儀器有限公司產品。

1.2 樣品制備方法

稱取1 g 云霧貢茶粉末于50 mL 錐形瓶中，以水作為提取溶劑，設置相應的超聲功率、超聲溫度、超聲時間，提取完成后，過濾得粗多糖提取液。往茶葉提取液中加入0.5 g 活性炭，攪拌均勻，40 ℃下恒溫水浴加熱15 min，進行脫色處理。Sevage 試劑（氯仿∶正丁醇= 4∶1，mL∶mL） 與多糖溶液混合，用磁力攪拌器振蕩35 min，再以轉速3 000 r/min 離心10 min 進行脫蛋白處理，收集上清液，即為脫蛋白的茶多糖提取液。

1.3 茶多糖提取率的計算

根據文獻[4-5]，采用硫酸- 蒽酮法。以葡萄糖質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為A=4.381 9C-0.005 2，R2=0.994 8，葡萄糖質量濃度范圍為0~0.02 mg/mL。吸取1 mL 脫蛋白茶多糖提取液，稀釋后參照標準曲線方法測定多糖得率，根據回歸方程和公式（1） 計算茶多糖提取率：

式中：Y——多糖提取率，%；

C——茶多糖質量濃度，mg/mL；

N——稀釋倍數；

V——供試液體積，mL；

m——甜茶質量，mg。

1.4 單因素試驗

參考文獻[6-8]，并結合爬坡試驗，設計單因素試驗，固定超聲功率100 W，超聲時間60 min，超聲溫度60 ℃，考查料液比（1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，g∶mL） 對茶多糖提取率的影響；固定料液比1∶80（g∶mL），超聲時間60 min，超聲溫度60 ℃時，考查超聲功率（50，100，150，200，250 W） 對茶多糖得率的影響；在料液比1∶80（g∶mL），超聲功率150W，超聲時間60 min 時，考查超聲溫度（40，50，60，70，80 ℃） 對茶多糖提取率的影響；在料液比1∶80（g∶mL），超聲功率150 W，超聲溫度70 ℃時，考查超聲時間（30，60，90，120，150 min） 對茶多糖提取率的影響。

1.5 數據處理

每個試驗隨機重復3 次，結果以X±S表示，單因素試驗采用Origin 2018 對試驗數據進行方差分析和圖形處理，用Design Expert 11.0 軟件進行響應面設計與結果分析[9]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對茶多糖提取率的影響

超聲功率對茶多糖提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對茶多糖提取率的影響

由圖1 可知，當超聲功率為50~150 W 時，茶多糖提取率呈上升趨勢，在150 W 時達到8.21%±0.38%，此后超聲功率增大，超聲波的空化效應也相應增強，茶葉提取率基本保持不變，所以選擇超聲功率150 W 為最佳提取功率。

2.1.2 超聲溫度對茶多糖提取率的影響

溫度升高，分子熱運動加快，所以多糖溶出的量會隨著溫度升高而增加，但因為多糖的結構復雜，羥基多，在高溫下不穩定，溫度過高，多糖容易降解。

超聲溫度對茶多糖提取率的影響結果見圖2。

圖2 超聲溫度對茶多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著超聲溫度的增加，多糖得率50~70 ℃上升幅度比較大，超過70 ℃后，增加比較少，所以選擇70 ℃為最佳超聲溫度。

2.1.3 超聲時間對茶多糖提取率的影響

隨著超聲時間的延長，在一定的溶劑濃度下，物質會達到飽和，就不會再溶出有效物質，多糖從茶葉中溶解出來的量會維持在一個水平不再增加。

超聲時間對茶多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對茶多糖提取率的影響

由圖3 可知，30~60 min 時溶出茶多糖的溶出率增加，90 min 以后不再變化。因此，選擇90 min 為最佳超聲時間。

2.1.4 料液比對茶多糖提取率的影響

料液比對茶多糖提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對茶多糖提取率的影響

隨著料液比的增加，多糖提取率增加，當料液比在1∶80 后，多糖溶出基本保持不變。一般來說，溶劑過少，溶出的有效物質在低濃度下溶出量有限，如果增加溶劑，有效物質的溶出也跟著增加，當提取溶劑達到一定量時，需要的目標物質已經大部分溶出，一些雜質也開始溶出，使得需要的目標物質含量不再增加，考慮到操作和節約成本，所用的溶劑越少越好。因此，選擇1∶80 進行響應面試驗。

2.2 響應面法優化結果分析

在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert 11.0 軟件，選擇超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）、料液比（D） 4 個因素為響應變量，茶多糖提取率（Y） 為響應值，設計四因素三水平的Box-behnken。

BBD 試驗因素及編碼水平設計見表1。

表1 BBD 試驗因素及編碼水平設計

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據表1 中的試驗因素和編碼水平，Design Expert 11.0 中Box-behnken 中心組合試驗設計，隨機產生了29 個試驗條件，其中有5 個是中心組合試驗，按表2 中的試驗設計進行試驗，通過計算得到茶多糖提取率，依次填入表中，并對表數據進行多元二次回歸分析。

Box-behnken 試驗設計及試驗結果見表2。

表2 Box-behnken 試驗設計及試驗結果

通過對表2 進行回歸分析，得到二次多項回歸模型方程為：

回歸模型的p＜0.000 1，回歸模型極顯著，失擬項的p=0.176＞0.05，失擬項不顯著，模型的確定系數R2=0.968 9，R2Adj=0.937 8 說明模型的擬合程度良好，該模型具有統計學意義，可用來預測和分析云霧貢茶多糖的提取工藝。模型中A，B，C，D的p值均小于0.001，說明各因素對茶多糖得率的影響極顯著。

回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析

2.2.2 各因素間交互作用分析

采用Design Expert 11.0 軟件，針對表1 和2 中的結果做響應面圖，響應面坡度的陡峭程度表明隨著因素的變化，其對應響應值的變化情況，如果坡度相對平緩，表明響應值可以忍受條件的變化；如果坡度較陡，表明響應值對于處理條件的變化非常敏感。

各因素相互作用對多糖提取率影響的響應面圖見圖5。

由圖5 可知，隨著超聲功率與超聲溫度、超聲功率與超聲時間、超聲功率與料液比、超聲溫度與料液比、超聲時間與料液比坡度均比較陡峭，說明這些條件的變化對茶多糖的提取影響比較大，隨著個因素的變化，均出現了茶多糖先增加后降低的情況，說明工藝優化找到了最佳的提取點，工藝優化成功，試驗模型可以很好地預測茶多糖的提取。

圖5 各因素相互作用對多糖提取率影響的響應面圖

采用Design Expert 11.0 軟件做相應的等高線圖，而等高線主要是反映因素間的交互作用情況，橢圓形表示因素間的交互作用明顯，圓形則表示交互作用不顯著。

各因素相互作用對多糖提取率影響的等高線圖見圖6。

由圖6 可知，超聲功率與超聲溫度、超聲溫度與超聲時間之間呈明顯的橢圓形，說明兩因素之間交互作用明顯，而超聲功率與超聲時間、超聲功率與料液比、超聲溫度與料液比、料液比與超聲時間之間的等高線呈圓形，交互作用不明顯。

圖6 各因素相互作用對多糖提取率影響的等高線圖

2.2.3 云霧貢茶中茶多糖提取工藝的驗證試驗

通過預測分析，結合單因素試驗結果可得多糖的最佳工藝條件為超聲功率182.011 W，超聲溫度69.412 ℃，超聲時間99.929 min，料液比1 ∶117.786（g∶mL），茶多糖提取率預測為9.617%，為簡便試驗操作，選擇為超聲功率180 W，超聲溫度69 ℃，超聲時間100 min，料液比1∶118（g∶mL）進行3 次平行試驗，云霧貢茶中茶多糖提取率為9.21%±0.25%，與預測值結果接近，說明該方法得到的優化條件可行。

3 結論

對綠茶多糖進行研究是實現茶葉深加工的方法之一，可以提高茶農收益，減少夏秋茶的浪費。多糖的提取一般采用水提醇沉法，因為超聲波具有空化效應，具有縮短提取多糖的時間，增加多糖提取效率的作用[10]。所以，采用超聲波提取茶多糖，方差分析中顯示，超聲功率、超聲溫度、超聲時間、料液比的p值均小于0.001，說4 個因素對茶多糖的提取影響均顯著；超聲功率與超聲溫度、超聲溫度與超聲時間之間的p值均小于0.05，等高線圖中均為明顯的橢圓形。所以，超聲功率與超聲溫度、超聲溫度與超聲時間之間還存在一定的交互作用，當超聲功率180 W，超聲溫度69 ℃，超聲時間100 min，料液比1∶118（g∶mL） 時，云霧貢茶中茶多糖的提取率為9.21%±0.25%。該工藝穩定可行，可以作為云霧貢茶中茶多糖的提取工藝。