即食玉米棒在加工過程中葉酸穩定性研究

薛寶玲，宋曉彬

（1. 內蒙古農業大學職業技術學院食品工程技術系，內蒙古包頭 014109；2. 內蒙古烏蘭察布市食品藥品檢驗所，內蒙古烏蘭察布 012000）

玉米作為一種重要的食品來源，也是全球第一大谷物[1]，營養豐富，堪稱“五谷之首”，全世界約有30%以上的人選擇玉米作為主食[2]。葉酸又稱維M、維B9，葉酸是維B 復合體之一，有促進骨髓中幼細胞成熟的作用，可改善血管內皮功能、預防心血管疾病[3-4]。葉酸在玉米中含量較高，適用于葉酸缺乏人群有效補充葉酸。

目前，天然植物中葉酸檢測的方法主要有微生物法和高效液相色譜法。高效液相色譜法的特點是測定結果準確、 操作簡便、省時省力、分析速度快、分離效果好[5]，是近年來發展速度較快的測定葉酸的方法。目前，世界范圍內利用高效液相色譜法來測定葉酸的產品范圍比較廣泛。而國內將其運用于檢測血漿、保健食品等中葉酸比較多，用于果蔬中葉酸檢測的報道甚少[6-8]。由于質譜儀高靈敏度的特性使其能夠檢測含量很低的樣品，并在定性和定量分析方面表現出巨大的優勢[9]，所以可以通過液質聯用來測定葉酸。主要研究玉米在不同加工過程中葉酸穩定性的變化規律，為加工中營養成分的保持提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的冷凍玉米，進行短暫的常溫解凍，100 ℃沸水下煮制，待玉米籽粒有香氣揮發時將玉米籽粒取出，液氮凍干機將玉米籽粒凍干，將干燥的玉米籽粒研磨成粉末，完全避光保存，待用。玉米籽粒真空包裝進行加工，加工后放入-80 ℃下保存，冷卻后拆開封口袋，按加工方式及對應的梯度分批次放入凍干機中研磨，避光干燥保存待用。

α - 淀粉酶，上海冠導生物工程有限公司提供；β - 巰基乙醇，山東三方化工集團提供；Na2HPO4·2H2O，NaH2PO4·2H2O，青島永潤化工科技有限公司提供；蛋白酶，上海翔陵化工有限公司提供；抗壞血酸鈉鹽，西安晉恒化工有限公司提供；甲醇、乙腈，天津市曾輝科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

ACCULAB ALC 型分析天平，梅特勒- 托利多儀器有限公司產品；pB-10 型pH 計，季爾國際貿易（上海） 有限公司產品；H2500R-2 型高速冷凍離心機，湘銳離心機儀器有限公司產品；水浴鍋，西安科創實驗室有限公司產品；DZF-603-A 型真空干燥箱，中國濟南天宇專用設備有限公司產品；ZXZ-2 型真空泵，天津市泰斯特儀器有限公司產品；BC/BD-608 型冷柜，金壇訊生儀器有限公司產品；DTH40 型玉米膨化機，上海印溪儀器儀表有限公司產品；KQ-600DE 型超聲波清洗器，上海光譜儀器廠產品；高效液相色譜儀，北京安捷倫有限公司產品；Arium 61316 型超純水器，賽多利斯儀器廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 新鮮玉米粒提取

取新鮮的冷凍玉米，常溫下解凍，在100 ℃沸水中煮制3~5 min，待玉米籽粒有香氣揮發時將玉米籽粒取出，使用液氮凍干機將玉米籽粒凍干約24 h 左右，使用研磨儀磨成所需的玉米樣品粉末（防止玉米樣品在稱取過程中受潮，造成試驗誤差），在干燥環境下分別稱取5 份250 mg 玉米粉末樣品，置于離心管封裝、標記樣品名稱，完全避光保存待用。

分別取3 份20 g 玉米籽粒真空包裝，封口后分別進行蒸制、煮制（不去掉真空包裝袋）、微波的加工處理。加工過程中每種加工方式取5 份250 μg 玉米籽粒樣品置于離心管中，分別進行的3 種加工方式，以加工時間為變量，蒸制使用蒸鍋蒸1，2，3，4，5 min，水量為1.5 L，煮制使用電磁爐煮40 s，1 min，2 min，3 min，4 min 水量為1 L，微波加工使用微波爐微波10，20，40，50，60 s。加工后放入冰箱在-80 ℃下保存，凍干研磨離心，標記加工方式和時間梯度，避光干燥保存，待用。

1.3.2 玉米葉酸提取條件優化

在進行不同加工方法下葉酸含量變化探究試驗之前，所需單因素條件不明確，需對提取過程中不同的單因素進行葉酸含量測定。在試驗過程中，所有的樣品都為非即時測定，需在-80 ℃下避光保存一段時間再進行測定。得出最優的各項單因素，從而可以優化測定條件，使不同加工方式下對即食玉米棒中葉酸含量的變化規律更加明顯易得，同時降低試驗誤差，精確最后需要的試驗數據。

單因素試驗指標及用量見表1。

表1 單因素試驗指標及用量

（1） 試驗試劑。α - 淀粉酶溶液40 mg/mL，水溶；蛋白酶溶液2 mg/mL，水溶；試驗用水，均為超純水；每100 mL 提取液；β - 巰基乙醇200 μL；0.1 mol/L Na2HPO4·2H2O；0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O；1×1=1 g 抗壞血酸鈉鹽；甲醇；乙腈。

（2） 試驗方案。提取液：先配置0.1 mol/L 磷酸二氫鈉，0.1 mol/L 磷酸氫二鈉，若預配置100 mL 提取液，則先在燒杯中添加設定的抗壞血酸鈉，再添加磷酸氫二鈉適量，最后添加磷酸二氫鈉，pH 計測定設定的pH 值，上述步驟完成，添加0.5 mL 的β -巰基乙醇，之后按如下步驟操作。

①取250 mg 玉米籽粒凍干粉于離心管中，加入5 000 μL 提取液渦旋振蕩器振蕩，使凍干粉與溶液充分混勻，100 ℃下加熱10 min。②冰上迅速冷卻，加入設定的α - 淀粉酶溶液，置于渦旋振蕩器中振蕩，使 α - 淀粉酶溶液與提取液充分混合，再置于金屬浴加熱振蕩器上振蕩30 min（37 ℃）。③加入設定的蛋白酶溶液，置于渦旋振蕩器中振蕩，使蛋白酶溶液與提取液充分混合，再置于金屬浴加熱振蕩器上振蕩60 min（37 ℃）。④取上清，加入設定的大鼠血清，金屬浴加熱振蕩器振蕩4 h 然后100 ℃加熱10 min，冰上冷卻10 min，離心處理（轉速9 000 r/min，時間10 min）。⑤取上層清液，用0.22 μm 有機濾膜過濾，將濾液裝入液相小瓶。

（3） 檢測色譜。根據相關資料，檢測色譜條件如下：①經HPLC 分析。測定標品在13.205 min 時出所需峰面積，所以大致在13 min 左右，將會得到試驗所需的樣品峰。②色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A 為乙腈，B 為0.1 mol/L NaH2PO4溶液（0~5 min，5%；5~20 min，梯度上升到20%；20~30 min 保持30~40 min，5%乙腈；pH 值7.0）；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量20 μL；柱溫35 ℃。③HPLC 流動相。試驗所需流動相為A：乙腈溶液500 mL，B：0.1 mol/L NaH2PO4溶液1 L。其中，0.1 mol/L NaH2PO4溶液需要在配制完成后進行超聲去氣泡溶解，抽濾裝置上進行過膜凈化，防止堵塞色譜柱；所有流動相溶液需現用現配。

（4） 葉酸含量計算。根據高效液相色譜法測定葉酸，根據標準品的葉酸含量和峰面積計算樣品葉酸含量的公式。所測定標準品的峰面積和質量濃度分別為328.4，100 μg/mL，峰面積與質量濃度呈正比，所以得到公式：

高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2 結果與分析

2.1 即食玉米棒葉酸提取單因素條件優化結果及分析

通過對即食玉米棒中測定葉酸的6 項單因素試驗，根據每項單因素的用量和HPLC 測定含量結果進行單因素試驗分析。

2.1.1 α - 淀粉酶對玉米棒中葉酸得率的影響

玉米含有大量的淀粉，α - 淀粉酶在提取液中的作用為酶解樣品中多余的淀粉，減少試驗誤差。在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化α - 淀粉酶用量。

α - 淀粉酶用量對提取玉米葉酸得率的影響見圖2。

圖2 α - 淀粉酶用量對提取玉米葉酸得率的影響

由圖2 可知，在60，80，100，140，180 μL 的α - 淀粉酶用量5 個水平下，隨著用量的增加，葉酸含量先增加再降低，在添加100 μL 時，葉酸含量達到最大值，隨后葉酸含量開始下降，卻定α - 淀粉酶的最佳用量為100 μL，即添加100 μL 質量濃度為40 mg/mL的α - 淀粉酶，表明該質量濃度下玉米籽粒粉末樣品中的淀粉對葉酸含量測定的干擾最低。

2.1.2 蛋白酶對玉米棒中葉酸得率的影響

添加蛋白酶在提取液中可以酶解植物蛋白，保留葉酸。在提取溫度為37 ℃，其他單因素及相同加工條件（煮制） 不變，變化蛋白酶用量。

蛋白酶用量對提取玉米葉酸得率的影響見圖3。

圖3 蛋白酶用量對提取玉米葉酸得率的影響

由圖3 可知，在0，10，20，30，40 μL 用量5 個水平下，隨著蛋白酶用量的增加，葉酸得率先增加再降低再增加，在添加質量濃度為2 mg/mL 的蛋白酶20 μL 后，葉酸含量開始下降。確認20 μL 蛋白酶為最佳用量，在該用量下，樣品中的蛋白對葉酸含量的干擾最低。

2.1.3 大鼠血清對玉米棒中葉酸得率的影響

大鼠血清在提取過程中起到酶解（軛合酶） 的作用。試驗在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化大鼠血清用量。

大鼠血清用量對提取玉米葉酸得率的影響見圖4。

圖4 大鼠血清用量對提取玉米葉酸得率的影響

由圖4 可知，在0，35，70，150，200 μL 用量5 個水平下，隨著用量的增加，葉酸含量先增加再降低，在添加大鼠血清70 μL 后，葉酸含量開始下降，提取過程中添加大鼠血清70 μL 為最佳用量，此時大鼠血清在提取液中的酶解效果最好。

2.1.4 β - 巰基乙醇對玉米棒中葉酸得率的影響

由于葉酸對光和熱不穩定，而在提取過程中樣品及提取液有時會處于不完全避光和熱不穩定的物理條件下，β - 巰基乙醇在提取過程中的作用是為了保護葉酸穩定性，防止葉酸降解及流失。對即食玉米棒提取葉酸時，提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化β -巰基乙醇用量。

β- 巰基乙醇對提取玉米葉酸得率的影響見圖5。

圖5 β - 巰基乙醇對提取玉米葉酸得率的影響

由圖5 可知，在100，300，500，700，1 000 μL用量5 個水平下，隨著β - 巰基乙醇用量的增加，葉酸含量先增加再降低，在添加500 μL 后，葉酸含量開始下降。因此，β - 巰基乙醇在提取過程中500 μL為最佳用量，此時β - 巰基乙醇對葉酸的保護效果最好。

2.1.5 pH 值對玉米棒中葉酸得率的影響

在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化pH 值即提取液的酸堿環境。

pH 值對提取玉米葉酸得率的影響見圖6。

圖6 pH 值對提取玉米葉酸得率的影響

由圖6 可知，在提取液pH 值為5.0，6.5，7.0，7.5，8.0 這5 個水平下，隨著pH 值的增加，葉酸得率先增加再降低，弱堿性下（pH 值＞7.0） 葉酸得率較高；當pH 值為7.5 時，葉酸含量開始下降，所以葉酸在提取過程中的提取環境酸堿度pH 值7.5 時為最佳提取液酸堿度，葉酸在弱堿性環境下的HPLC提取含量最高。當流動相的有機相比例和pH 值偏酸性時，葉酸的保留時間越長，得到的色譜峰形較差，而且低pH 值也會影響葉酸的穩定性。

2.1.6 抗壞血酸鹽對玉米棒中葉酸得率的影響

在抗氧化的單因素試驗中，考慮到試驗成本、抗氧化效果，以及提取體系下葉酸的最適酸堿度為弱堿性，選擇抗壞血酸鹽（抗壞血酸鈉） 作為抗氧化劑。即在提取溫度為37 ℃，其他5 項單因素及相同加工條件（煮制） 不變的情況下，變化抗壞血酸鹽用量。

抗壞血酸鹽對提取玉米葉酸得率的影響見圖7。

圖7 抗壞血酸鹽對提取玉米葉酸得率的影響

由圖7 可知，抗壞血酸鹽在0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 g 這5 個用量水平下，隨著用量的增加，葉酸得率先增加再降低，在添加1.00 g 后，葉酸得率開始下降，所以抗壞血酸鹽在該梯度下，提取過程中添加1.00 g 抗壞血酸鹽為最適量，對葉酸保護效果較好。

為了試驗結果的準確性，需要在提取葉酸的提取液中加入去除淀粉、植物蛋白、防止葉酸氧化及穩定葉酸結構的物質，在稱取α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、pH 值、抗壞血酸鹽、β - 巰基乙醇時盡量統一稱取，較少試驗誤差。在操作過程中，盡可能在低溫和避光的環境下進行，對于試驗所用到的容器，也盡量使用棕色瓶，試驗過程中也可以通過使用封口膜來防止樣品有雜質混入或者溫度升高。在純化樣品過程中，加入適量的β - 巰基乙醇，能很好地保護5- 甲基四氫葉酸，盡可能減少損失。

在α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、pH 值、抗壞血酸鹽、β - 巰基乙醇這6 種單因素下，計算出這6 項單因素的最優葉酸含量分別16.45，16.72，18.25，16.95，16.39，16.39 μg/μL。

葉酸提取優化條件見表2。

表2 葉酸提取優化條件

由表2 可知，大鼠血清的最優用量對葉酸的保護效果較好，所得峰面積較大，測定的葉酸含量較高，單因素中以pH 值影響較小，所以確定在保護葉酸的試驗中，優先使用大鼠血清作為樣品軛和酶。

2.2 不同加工方法下葉酸的提取結果及分析

應用單因素確定的最優條件3 種不同加工方式進行不同方式下葉酸的測定，對比3 種加工條件下的葉酸含量，確定何種加工方式下葉酸的穩定性更佳。

不同加工方式測定結果見表3。

表3 不同加工方式測定結果

由表3 可知，蒸制即食玉米棒中提取出的葉酸含量為22.73 μg/μL，明顯高于煮制、微波的加工方法，蒸制為最優加工方式。對比其他3 種加工方式，在6 項單因素完全相同的提取液中，避光操作試驗下，葉酸含量呈現蒸制3 min ＞微波40 s ＞煮制2 min。

3 結論

通過單因素試驗，結合對比3 種不同加工方式下提取即食玉米棒中葉酸含量試驗中出現的問題。

通過單因素試驗結合對比3 種不同加工方式來優化即食玉米棒中葉酸的提取工藝，確定葉酸在何種單因素和加工方式下更加穩定。在葉酸的提取過程中，α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、β - 巰基乙醇、pH 值、抗壞血酸鹽經過HPLC 測定后得出的最優條件為100，30，70，500 μL；pH 值7.5，1 g。對葉酸得率的影響程度為蒸制3 min，加工測定的葉酸含量22.73 μg/μL＞微波40 s 加工測定的葉酸含量19.76 μg/μL＞煮制2 min 加工測定的葉酸含量17.57 μg/μL。結果表明，煮制的條件下葉酸的損失率較大。