基于網絡藥理學研究薺菜治療高血壓的作用機制

廖雨冰，汪宏譯，尹白云，蔡陽美，于天豪，王岐本

（湘南學院 基礎醫學院，湖南 郴州 423043）

高血壓（Hypertension），是血液在血管中流動時 對血管壁造成的壓力值持續高于正常的現象。高血壓是心腦血管病最主要的危險因素之一[1]。以體循環動脈壓增高為主要表現[2]，可伴有多器官相應并發癥狀和器質性損傷。目前，得到廣泛認可的高血壓診斷標準是收縮壓≥140 mmHg 或舒張壓≥90 mmHg。據最新數據顯示人群患病風險持續加大[3]。目前，絕大多數患者采取的是長期藥物保守治療方式。薺菜（Capsella bursa-pastoris（Linn.）Medic.） 具有降血壓的功效，可用于治療血崩、高血壓等[4]，還具有多種藥理活性，如降脂降壓、消炎抗病毒、防癌抗癌等[5-6]。研究表明，薺菜中的活性成分山奈酚具有抗氧化、抗炎等作用，還可內皮依賴性舒張血管，抑制AngⅡ導致的血管重構，同時通過抑制IKK/NFκB 炎癥損傷IRS-1 改善II 型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，并可調節血脂。此外，山奈酚不僅能抑制銅離子誘導LDL 氧化成ox-LDL，而且還可以降低THP-1性巨噬細胞表面CD36 蛋白表達，阻止其對ox-LDL的攝取，從而預防動脈粥樣硬化，可預防動脈粥樣硬化，從而相對緩解高血壓癥狀，對高血壓起到一定的輔助治療作用[7-8]。中醫臨床中也常用包括薺菜在內的中藥復方治療高血壓，由此可見薺菜在治療高血壓方面具有良好的潛力[9]，然而目前對于薺菜治療高血壓的藥理作用及試驗研究還未成熟，薺菜發揮高血壓治療作用的分子機制尚未完全闡明。研究借助網絡藥理學，為探究薺菜治療高血壓提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 薺菜活性成分及藥物靶點的篩選

首先篩選薺菜的化學成分，用TCMSP（https：//tcmsow/tcmsp.php）。將藥代動力學性質作為首要篩選依據。設置口服生物利用度（OB） ≥30%，類藥性（DL） ≥0.18。所得到的結果作為初步篩選得到的藥物有效成分。將初步得到的藥物有效成分在Uniprot 數據庫（http：//www.uniprot.org/） 和String 數據庫（https：//string-db.org/） 中進行查詢得到靶標蛋白的基因名稱，得到了薺菜的相關基因靶點。

1.2 高血壓疾病靶點的獲取

以“hypertension”為關鍵詞，在人類基因組注釋數據庫Gene Cards（https：//genecards.weizmann.Ac.il/v3/） 中搜索，獲取高血壓靶點。

1.3 構建“藥物- 活性成分- 共同靶點- 疾病”網絡圖

通過韋恩圖，把高血壓的疾病靶點和藥物活性成分的靶點進行篩選分析，將得到二者的共同靶點，將共同靶點作為薺菜治療高血壓的潛在作用靶點。

1.4 靶蛋白相互作用網絡（PPI） 的構建與分析

把已經篩選出來的薺菜治療高血壓的潛在作用靶點導入String 數據庫，限定篩選物種為“Homo”（人類），相互作用閾值設置為0.4，其余篩選條件保持不變，進而得到蛋白的相互作用關系；利用Cytoscape 3.8.2 獲得薺菜治療高血壓的關鍵靶點的相互或用結果（PPI 網絡圖）。

1.5 GO 功能分析及KEGG 信號通路富集分析

使用Metascape（http：//metascape.org） 將篩選條件設置為p＜0.01，min overlap=3，min enrichment=1.5，將在此條件下篩選得到的靶點進行GO 和KEGG通路分析。

1.6 構建“藥物- 活性成分- 靶點- 通路”之間的關系網絡

在Cytoscape 3.8.2 數據庫中導入前述篩選的活性成分、靶點及KEGG 富集到的主要信號通路，用以構建“藥物- 活性成分- 靶點- 通路”網絡圖。

2 結果與分析

2.1 薺菜活性成分

薺菜部分活性成分的基本信息見表1。

表1 薺菜部分活性成分的基本信息

2.2 高血壓疾病靶點的獲取結果

在GeneCards 數據庫中查找共得到高血壓相關靶點8 873 個高血壓疾病靶點基因。

2.3 “藥物- 活性成分- 共同靶點- 疾病”網絡圖的構建

集采活性成分對應靶點基因70 個。將結果進行Venn 分析，獲得共同靶點65 個（圖1），與之對應得薺菜活性成分為10 個。用Cytoscape 3.8.2 進行蛋白網絡結構的處理，將結果可視化。網絡中共108 個節點，相互作用的邊160 條（圖2）。其中，度值相對較高的化合物有Kaempferid（山柰素）、Gossypetin hexamethyl ether（棉花皮素六甲醚）、Sinoacutine（清風藤堿）、beta-carotene（β - 胡蘿卜素）、yohimbine（鹽酸育亨彬） 等。

薺菜治療高血壓（AD） 的藥物- 疾病共同靶點韋恩圖見圖1，薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分- 共同靶點- 疾病”網絡圖見圖2。

圖1 薺菜治療高血壓（AD） 的藥物- 疾病共同靶點韋恩圖

圖2 薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分-共同靶點- 疾病”網絡圖

2.4 靶蛋白相互作用（PPI） 網絡的構建及分析

薺菜抗高血壓的PPI 網絡圖見圖3。

圖3 薺菜抗高血壓的PPI 網絡圖

PPI 圖中共64 個節點，465 條相互作用連線。經計算， PPI 中節點平均自由度為14.50。將潛在靶點信息按照Degree 值排名整理后分析，前8 個分別為ALB，AKT1，VEGFA，JUN，CASP3，MYC，ESR1，PTGS2。

薺菜抗高血壓的潛在關鍵靶點見表2。

表2 薺菜抗高血壓的潛在關鍵靶點

2.5 GO 分析及KEGG 信號通路分析

共富集得到50 個條目，其中分子功能條目15 個（cellularcomponent，CC），生物過程條目17 個（biologicalprocess， BP），細胞組成條目18 個（molecularfunction，MF）。

薺菜治療高血壓的潛在作用靶點的GO 分析見圖4，薺菜抗高血壓的潛在作用靶點的KEGG 信號通路富集分析見圖5。

圖4 薺菜治療高血壓的潛在作用靶點的GO 分析

圖5 薺菜抗高血壓的潛在作用靶點的KEGG 信號通路富集分析

KEGG 信號通路分析篩選一共得到15 條通路，對之前得到的薺菜治療高血壓的潛在作用靶點進行通路富集分析（圖5），得到靶點數量前6 位的信號通路為節律過程、有機羥基化合物轉運、丙型肝炎與肝細胞癌、單胺GPCR、促腎上腺皮質激素釋放激素信號通路，離子轉運的調節?？烧J為是薺菜治療高血壓的核心通路[10-14]。

2.6 “藥物- 活性成分- 靶點- 通路”網絡的構建與分析

薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分- 靶點-通路”網絡圖見圖6。

圖6 薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分- 靶點- 通路”網絡圖

將KEGG 信號通路富集結果前6 位的通路和薺菜的有效活性成分、作用靶點之間結合，構建藥物、活性成分、靶點、通路4 個要素之間的網絡圖，（圖6）。共11 種活性成分作用于上述6 種信號通路。其中，beta-carotene（β - 胡蘿卜素）、Sinoacutine（清風藤堿）、yohimbine（鹽酸育亨彬） 共63 個靶標發揮重要作用，其中AKT1，OPRM1，NOS2，GJA1發揮作用最為明顯，將之作為薺菜治療高血壓的關鍵靶點。提示薺菜主要通過節律過程、有機羥基化合物轉運、丙型肝炎與肝細胞癌、單胺GPCR、促腎上腺皮質激素釋放激素信號通路、離子轉運的調節幾條通路發揮治療高血壓的作用。

3 結論

高血壓是我國高發的典型慢性病、常見病之一。其中醫病機多與飲食、情志、遺傳等因素引起的氣血陰陽不調有關，肝風、脾濕、腎虛各為病之標、病之源及病之本[15]?，F代醫學則認為其發病受多種機制的相互影響，如RAAS 系統、炎癥反應、氧化應激、膜離子轉運、免疫細胞浸潤等[16]。這些機制長期惡性作用，會破壞血管內穩態，導致血管舒縮功能失調、外周阻力增加等問題，進而造成血壓升高。薺菜具有和脾等功效，可用于輔助治療高血壓引起的水腫、面紅目赤等癥狀。但具體活性成分及其作用通路尚不清楚。網絡藥理學是基于系統生物學和多向藥理學設計的學科。便于從分子角度構建藥物-活性成分- 共同靶點- 疾病網絡圖，梳理藥物與疾病之間的作用關系，達到精準治療的目的[17-18]。因此，采取此模式探討薺菜活性成分抗高血壓的潛在作用機制。

通過TCMSP 數據庫，以OB≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，同時參考BBB 值進行薺菜藥效成分篩查，得到可能有顯著降壓療效的12 種成分。其中，山柰素、棉花皮素六甲醚、清風藤堿、β - 胡蘿卜素、鹽酸育亨彬為關鍵成分，鄰苯二酸酯等起協同作用（圖2）。有研究表明，山奈酚具有抗炎等作用，還可內皮依賴性舒張血管，抑制AngⅡ導致的血管重構，同時通過抑制IKK/NF-κB 炎癥損傷IRS-1改善II 型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，并可調節血脂[16]。此外，山奈酚不僅能抑制銅離子誘導LDL 氧化成ox-LDL，而且還可以降低THP-1 性巨噬細胞表面CD36 蛋白表達，阻止其對ox-LDL 的攝取，從而預防動脈粥樣硬化，可相對緩解高血壓癥狀[19]。清風藤堿具有明顯抗炎、免疫調節、保肝、降血壓等作用[20]。例如，胡祚俊等人[21]采用大量臨床對照試驗證明小花清風藤能有效治療病毒性肝炎等。邱模昌等人[22]認為，β - 胡蘿卜素能降低高糖誘導的臍靜脈內皮細胞的損傷，機制可能與增加NO 水平和促進ROS 的降解有關。郭錦晨等人[23]認為，β - 胡蘿卜素能降低LDL 氧化、消除自由基、預防血管損傷。此外，收集到的薺菜與高血壓共同靶點基因65 個，包含了多個抗炎、抗氧化、保護血管等因子，表明薺菜治療高血壓是多成分、多靶點協同作用的結果。

將65 個藥物- 疾病共同靶點導入String 數據庫中，獲取靶標蛋白互作關系，并于Cytoscape 3.8.2 中繪制得到1 個以AKT1，VEGFA，JUN，PTGS2 等為核心靶點的具有26 個節點和155 條連線的PPI。其中，血管內皮障礙相關基因AKT1 等通過MAPK 信號通路促進血管內皮細胞的增殖，從而加速血管生成，并與高血壓的發生密切相關[24]。VEGFA 作為血管內皮細胞生長因子，可誘導新生血管形成并調節血管張力[25]。JUN 是AP-1 的組分之一，而AP-1 可誘導IL6，IL10，TNF 等的表達，引起血管內皮細胞及炎癥細胞的增殖，使管壁向內增厚致血壓升高[26]。AP-1 可調控高血壓心肌肥厚相關基因的早期應答，并可在一定程度上軟化老年高血壓動脈[24]。PTGS2在受到細胞因子、炎性介質、缺氧等刺激可迅速上調，激活血小板和內皮細胞上的相關受體，使血管平滑肌松弛并抑制血小板聚集，以降低血壓。同時，其生成的前列腺素還能促進細胞增殖和加速血管生成[25，27]。不僅如此，PTGS2 還與女性高血壓密切相關[28]。分子對接證明PTGS2 與山柰酚、β - 胡蘿卜素等能較好地結合且構象穩定，共同發揮作用，可能是薺菜治療高血壓的重要成分靶點所在[23]。

對潛在關鍵靶點進一步作GO 富集及KEGG 通路分析，更深入地探討薺菜的作用機制。如圖4 和圖5 顯示，薺菜可能通過參與細胞的刺激反應、細胞通訊信號轉導、有機物代謝過程等生物學過程，在細胞核腔、囊泡、細胞器內膜系統等部位，發生蛋白質二聚活性激活、腎上腺素能受體、G 蛋白偶聯胺受體活性激活、腎上腺素能受體活性激活、蛋白質結合等分子反應，進而調控生物節律過程通路、有機羥基化合物轉運通路、丙型肝炎與肝細胞癌信號通路、促腎上腺皮質激素釋放激素信號通路、單胺GPCR 信號通路、離子轉運調節信號通路等發揮降壓作用。有研究表明，有機羥基化合物的作用機制與血管內皮生長因子（VEGF） 有關。劉崇棟等人[29]發現，聚乙二醇等高分子材料可通過緩慢釋放VEGF以延長其在體內活性維持時間，從而促進血管生成。任麗麗等人[30]認為，10 HCPT 能抑制RASF 表達VEGF水平，從而抑制血管新生。GPCRs 可替代內皮素- 1等血管活性物質的信號轉導者以調節血壓，且GPCRs若激活不當可引起高血壓和血管功能障礙[31]。CRH 在一定濃度內可降低HaCaT 細胞VEGF mRNA 和蛋白的表達[32]。離子通道對于高血壓疾病意義重大，尤其是鈣離子通道，可影響心肌收縮、血管張力等。阻滯鈣離子內流可有效舒張血管并降低外周血管阻力，具有良好的療效[18]。

綜上所述，根據網絡藥理學系統地分析了薺菜治療高血壓的作用機制，揭示了其治療高血壓潛在的活性成分及作用網絡，證明了薺菜主要是通過改善血管內皮功能、促進血管新生來達到治療目的，具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點。為進一步探討薺菜針對高血壓的輔助治療發揮作用的藥效物質基礎和作用機制研究提供方向，其后續尚需體內外試驗進一步證實其功效網絡的內在關聯和作用靶點。