基于生物信息學分析膠質母細胞瘤中RUNX1基因的表達及臨床意義*

陳亞倫，宋 彥

(南陽市第二人民醫院神經內科，河南 南陽 473012)

膠質母細胞瘤(GBM)也稱為多形性成膠質細胞瘤，其生長迅速、侵襲性強，是成人最常見的惡性腦腫瘤。與其他固體腫瘤不同，GBM能夠廣泛地侵犯周圍腦組織而很少發生轉移[1]。目前，GBM的標準治療包括外科手術切除和替莫唑胺聯合放射治療。但是，經過標準治療的腫瘤患者，病情仍然會進一步發展，導致患者的中位生存期和無疾病進展期明顯縮短，分別僅為16、7個月，其5年生存率不超過9.8%[2-4]。另外，GBM發生的分子機制仍然不是很清楚。因此，深入研究GBM惡性生長與侵襲的分子機制，對于研發新的治療方法和藥物，以及改善GBM患者的生存預后具有重要意義。

本研究通過對GBM相關的三組基因芯片數據進行分析，發現了關鍵的促癌基因 Runt相關轉錄因子1(RUNX1)。RUNX1是RUNX轉錄因子家族的成員，主要參與細胞的增殖和分化等過程[5]。已有研究表明，RUNX1在多種人類腫瘤中異常表達，比如乳腺癌、前列腺癌和肺癌等，在腫瘤的發生、發展中起著重要作用[6-8]。但是，RUNX1在GBM中的作用仍少有報道，因此，本研究通過生物信息數據庫挖掘的方法，尋找GBM的潛在預后指標或分子標志物，并初步分析了RUNX1的表達與GBM發生的關系及作用機制，以期能夠為GBM的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料來源 檢索GEO數據庫中GBM基因芯片。通過GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行檢索和篩選[9]，得到GBM相關的基因芯片GSE50161、GSE108476和GSE15824。它們均來源于相同的平臺GPL570 ([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。GSE50161含34例腫瘤組織和13例正常組織。GSE108476含221例腫瘤組織和28例正常組織。GSE15824含12例腫瘤組織和2例正常組織。三組芯片共含有GBM組織樣本267例和正常對照組織樣本43例。

1.2方法

1.2.1篩選差異表達的基因和繪制文恩圖 使用GEO數據庫中的GEO2R工具進行分析，分為GBM組和正常對照組進行比較。下載并整理GEO2R的所有結果數據。兩組間基因表達差異2倍以上(logFC>2或logFC<-2)且差異有統計學意義(P<0.05)，認為是基因差異表達顯著。使用文恩圖在線分析軟件(Venny2.1.0)分析三組芯片的上調和下調差異基因，同時取交集，篩選出共同的差異表達基因。

1.2.2GBM和正常組織中差異基因的表達及生存預后分析 通過TCGA數據庫分析工具：GEPIA在線工具分析差異基因在GBM和正常組織中的表達、生存預后及相關性表達。基因表達譜交互分析(GEPIA)數據庫是整合了TCGA 癌癥大數據與 GTEx 正常組織大數據，利用生物信息學技術深入挖掘相關數據，并對基因表達譜數據進行動態分析的TCGA可視化工具[10]。通過檢索目的差異基因，選擇GBM組織進行分析，可獲得目的基因的表達情況、生存預后及基因相關性分析。

1.2.3目的基因的轉錄因子分析 JASPAR數據庫(http://jaspar.genereg.net/)是一種高質量，非冗余轉錄因子數據庫，涵蓋了源于已經實驗證實的真核生物轉錄因子結合位點等信息[11]。通過分析RUNX1轉錄因子結合的序列特征及補體調節因子I(CFⅠ)基因的啟動子序列特征，檢測RUNX1與CFⅠ之間是否存在轉錄調控關系。

1.2.4單細胞測序數據分析 腫瘤免疫單細胞中心(TISCH)是一個專注于腫瘤微環境(TME)的scRNA-seq數據庫(http://tisch.comp-genomics.org/home/)，其對單細胞水平提供了詳細的細胞類型注釋，使不同癌癥類型的TME得以探索[12]。通過TISCH數據庫，選擇GBM進行分析，在單細胞層面檢測RUNX1在GBM微環境中的表達情況。

1.2.5蛋白相互作用網絡分析 GeneMANIA (http://genemania.org/)是構建蛋白相互作用網絡工具Cytoscape中的插件，具有預測基因的功能和構建相互作用網絡的功能[13]。輸入RUNX1基因，獲得RUNX1的相互作用蛋白，并選擇KEGG pathway輸出其參與的信號通路。

1.2.6細胞培養 GBMU87MG細胞株采用含10%胎牛血清的高糖培養基(DMEM)進行培養，細胞培養箱的條件為溫度37℃、5%濃度CO2。于細胞增殖對數期進行換液處理。

1.2.7熒光定量PCR實驗(RT-qPCR) 根據說明書，使用Trizol試劑提取細胞的總RNA，分光光度計檢測RNA的純度和濃度，參照逆轉錄試劑盒，反轉RNA為cDNA。然后進行實時RT-PCR擴增。每個樣本設置3個復孔，擴增反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共進行40個循環。計算反應c(t)值及目的基因的相對表達量。每次實驗進行3次重復。引物序列如下：GAPDH上游5′-TGC CAC TCA GAA GAC TGT GG-3′，下游5′- TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT；CTNNB1上游5′-GAA AAT GGT TGC CTT GCT-3′，下游5′-GAT GAG CTT GCT TTC TTG G-3′；MYC上游5′-GCC AGA GGA GGA ACG AG-3′，下游5′-GCT TGG ACG GAC AGG AT-3′；CD44上游5′- CAA GCC ACT CCA GGA CAA GG -3′，下游5′- ATC CAA GTG AGG GAC TAC AAC AG -3′。GAPDH為內參。

1.2.8siRNA轉染干擾RUNX1的表達 在細胞生長匯合度達到40%左右時，進行siRNA的轉染操作。使用無血清培養基分別預混siRNA和轉染試劑Lipofectamine 2000，然后將siRNA和Lipofectamine 2000進行混勻，室溫靜置5 min后，加入細胞培養基中轉染細胞，8 h后更換新鮮培養基，24 h后進行細胞RNA的提取和干擾效率檢測。RUNX1 siRNA序列為：5′-CCA GGU UGC AAG AUU UAA UTT-3′。

1.2.9細胞增殖實驗 收集處理后的細胞，計數細胞濃度，調整細胞懸液的濃度為每100微升500個細胞，每組細胞樣品每天設置3個重復，96孔板中加入100 μL的細胞懸液，放于細胞孵育箱中培養。每天固定時間點進行檢測，加入10 μL的CCK-8試劑，于細胞孵育箱中孵育2 h。于酶標儀中測量450 nm處的吸光度值(A)，連續測量5 d并繪制細胞增殖曲線。

2 結 果

2.1分析并篩選GBM和正常腦組織中的差異基因 分析GEO數據庫中GSE50161、GSE108476和GSE15824三組GBM相關的基因芯片數據，并下載相關的表達數據。選取差異倍數2倍以上，且差異有統計學意義(P<0.05)的基因為差異基因。通過GEO2R的在線分析工具，篩選得到三組基因芯片的差異基因。在GSE50161芯片中篩選得到差異基因共2 117個，上調的差異基因有876個，下調的有1 241個；在GSE108476芯片中共得到差異基因1 393個，上調的差異基因有445個，下調的有948個；在GSE15824芯片中發現差異基因共1 152個，上調的差異基因有564個，下調的有588個。通過維恩圖工具(Venn)對三組芯片的差異基因取交集，結果得到共表達的差異基因20個，其中8個基因表達上調：TMEM39A、PXDN、PRRX1、RUNX1、TGIF2、CFⅠ、AJUBA和LAMA4；12個基因表達下調：SLC6A15、CLCN4、CHN2、OR2L1、ENPP2、RGS11、ANKS1B、KIAA1107、PDE1A、SPNS2、ATP8A1和ANKRD29。

2.2TCGA數據庫分析差異基因在GBM中的表達 通過TCGA數據分析工具GEPIA，在163例GBM組織和207例正常對照組織中，分析上調的差異基因表達情況。結果發現，TMEM39A、PXDN、PRRX1、RUNX1、TGIF2、CFⅠ、AJUBA和LAMA4這8個基因在GBM組織中的表達明顯高于正常組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

與正常對照組織比較，aP<0.05。

2.3基因RUNX1和CFⅠ表達對GBM患者臨床預后的影響 通過GEPIA數據庫進一步分析這些差異基因的表達與患者預后的關系，結果發現，8個上調的差異基因中，只有RUNXI和CFⅠ基因對腫瘤患者的生存預后有顯著相關性[相關系數(r)=0.6，P<0.05]，即RUNX1和CFⅠ高表達的腫瘤患者總生存期和無疾病進展期比低表達的患者明顯縮短，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。這些結果提示RUNX1和CFⅠ高表達預示GBM患者的臨床預后較差。

A.GBM患者總生存期(RUNX1基因)；B.GBM患者無疾病進展期(RUNX1基因)；C.GBM患者總生存期(CFⅠ基因)；B.GBM患者無疾病進展期(CFⅠ基因)。

2.4RUNX1可能在轉錄水平上影響CFⅠ基因的表達 通過JASPAR轉錄因子分析數據庫分析發現，CFⅠ基因中具有RUNX1結合的位點(圖3A)。另外，通過分析TISCH單細胞測序數據庫，可見RUNX1在免疫細胞及腫瘤細胞中均呈高表達(圖3B)。這些結果表明，RUNX1可能通過轉錄調節CFⅠ的表達進而影響免疫反應，促進腫瘤的進展。

A.轉錄因子RUNX1結合的核苷酸位點，以及JASPAR結果顯示CFⅠ基因中RUNX1可以結合的核酸位點；B.GSE131928，GSE141982和GSE84465的單細胞測序芯片中，RUNX在免疫細胞、腫瘤細胞、基質細胞中的表達水平。

2.5RUNX1參與調節的信號通路網絡 通過GeneMANIA蛋白相互作用網絡數據庫及KEGG pathway進一步分析RUNX1參與調節的生物學過程。結果顯示，RUNX1能夠與細胞分裂蛋白激酶6(CDK6)、癌基因MYC、癌基因CBFB等20種蛋白存在相互作用，主要參與的生物學過程有：調節細胞的增殖和分化、DNA綁定、補體級聯反應、細胞黏附和NOD樣受體信號通路等。

2.6RUNX1調節Wnt信號通路促進GBM的增殖 鑒于RUNX1參與調節腫瘤細胞的增殖，以及上述相互作用網絡分析得到了其相互作用的蛋白。本研究初步分析了其可能調控的增殖的相關信號通路。通過TCGA數據分析，發現RUNX1與Wnt信號通路的核心蛋白β-catenin具有明顯的正相關性(r=0.21，P<0.05)，且RUNX1與Wnt信號的下游靶基因CD44和MYC也具有顯著的正相關性(r=0.43，P<0.05；r=0.22，P<0.05)。為了進一步驗證RUNX1是否參與Wnt信號通路的調節，本研究在GBM細胞中敲低RUNX1，RT-qPCR結果顯示RUNX1被干擾后，Wnt通路的下游分子β-catenin(基因名CTNNB1)及下游靶基因MYC和CD44 的mRNA水平也明顯下調(圖4A)。另外，通過CCK-8細胞增殖實驗發現，RUNX1下調明顯抑制了腫瘤細胞的增殖(圖4B)。這些結果表明，RUNX1可能通過調節Wnt/β-catenin信號促進GBM的進展。

A.敲低RUNX1對CTNNB1、MYC和CD44的mRNA表達影響；B.CCK-8實驗檢測敲低RUNX1對細胞增殖的影響；與正常對照組比較，aP<0.05。

3 討 論

GBM是膠質瘤中惡性程度最高的類型，盡管GBM的發病率約為3.19/10萬人，但是由于其復雜的生物學特征和有限的治療方法，致使其臨床預后極差[14]。即使經過手術或者放射治療，這種腫瘤仍會侵犯周圍正常的腦組織，導致病情的進展或復發[15]。因此，亟須深入研究GBM的發病機制，這對于制定有效的治療策略和改善患者預后具有非常重要的臨床意義。在腫瘤的發生、發展過程中，基因表達上調發揮著促進腫瘤的作用，因此在臨床上更有利于檢測和診斷腫瘤。鑒于此，本研究主要分析GBM中上調的差異表達基因。

近年來，基因組分析和高通量測序技術的進展，使得學者們能夠更全面和深入地理解GBM的發病機制，并鑒定潛在的GBM預后和治療的新靶點。本研究通過對三組GBM基因芯片(包含267例腫瘤組織和43例正常腦組織)進行分析，發現在GBM中異常高表達的基因RUNX1和CFⅠ。RUNX1是一種十分重要的轉錄因子，其在細胞增殖、細胞分化和造血細胞的形成中具有重要的調控作用。其最早是在髓系白血病中被發現，發揮抑癌的作用[16]。但是，新的研究發現RUNX1也具有促進白血病細胞增殖的作用[17]。由此可見，RUNX1在不同類型的血液系統腫瘤中具有不同的功能。在不同的實體腫瘤中，RUNX1也表現出功能的組織異質性。例如，RUNX1在肝癌中的表達明顯低于癌旁組織，且肝癌組織中RUNX1存在較高的突變，這提示RUNX1在肝癌的發生過程中起著抑癌的作用[18]。而在非小細胞肺癌中，有研究發現RUNX1在肺癌組織中呈高表達，且能夠增強腫瘤細胞的化療耐藥[19]。另一基因CFⅠ是補體系統的重要調節因子，主要通過絲氨酸蛋白酶的功能裂解C4b和C3b，從而調劑補體系統的激活。當補體激活后，具有生物活性的肽C5a和C3a可誘導多種促炎癥效應，從而促進腫瘤發生、發展[20]。已有研究表明，CFⅠ在多種人類腫瘤中具有重要作用，比如皮膚鱗狀細胞癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌等[21-23]。在乳腺癌的研究中，發現CFⅠ在乳腺癌組織中顯著高表達，且CFⅠ在腫瘤細胞、浸潤的免疫細胞和成纖維細胞中均有表達。進一步分析發現，CFⅠ的高表達與腫瘤的大小和病理分級具有顯著相關性，且其高表達與乳腺癌患者生存期和無疾病進展期的縮短呈正相關[24]。

CFⅠ基因編碼的蛋白為補體因子Ⅰ，主要參與補體系統的級聯反應和免疫反應[25]。而RUNX1是RUNX轉錄因子家族中非常重要的成員，其能夠與許多增強子或啟動子的核心元素結合，從而調節下游靶基因的轉錄和表達[26]。本研究通過TCGA數據庫分析，發現RUNX1和CFⅠ在GBM中的表達均異常升高，且它們的高表達預示著GBM患者的不良預后。那么RUNX1作為轉錄因子是否可能調控CFⅠ的表達？考慮到RUNX1是一重要的轉錄因子，且RUNX1與CFⅠ的表達具有顯著的相關性。通過轉錄因子的數據庫分析發現，RUNX1能夠與CFⅠ的啟動子區域結合，表明RUNX1可能在轉錄水平調控CFⅠ的表達。另外，結合最新的單細胞測序數據分析，發現RUNX1在腫瘤細胞及免疫細胞中均呈高表達。據此，可以推測RUNX1在腫瘤細胞及免疫細胞中均發揮著重要的調控作用。考慮到CFⅠ主要參與免疫反應的調節，而RUNX1又能夠調節CFⅠ的表達。由這些證據可以推測，RUNX1在免疫細胞中可能通過轉錄上調CFⅠ的表達，抑制補體系統的激活和免疫反應，從而有助于GBM的進展。而在腫瘤細胞中的具體作用機制，通過蛋白相互作用網絡及KEGG Pathway分析，初步揭示了RUNX1調節GBM增殖的潛在分子機制。癌基因MYC是一種涉及細胞增殖和分化的關鍵因子，受到Wnt/β-catenin信號通路的調控[27]。本研究發現，RUNX1可能通過調節Wnt/β-catenin信號，上調β-catenin的表達及促進癌基因MYC和CD44的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖。Wnt/β-catenin信號在調節干細胞的多能性、器官發生及腫瘤發生過程中具有重要的作用。當Wnt信號激活時，升高的β-catenin進入細胞核，與細胞核內T細胞因子/淋巴增強因子(LEF/TCF)轉錄因子結合，調節下游靶基因c-MYC、CD44、MMP7等的表達，從而參與細胞增殖、侵襲和腫瘤進程的調節[28-29]。

綜上所述，本研究通過挖掘高通量的生物信息數據，發現了GBM中具有潛在臨床預后價值的標志物RUNX1和CFⅠ，并初步探索了RUNX1發揮作用的可能機制，即RUNX1在免疫細胞中可能通過轉錄調節上調CFⅠ的表達，抑制補體反應，從而使腫瘤細胞逃脫免疫監視；另一方面，RUNX1在腫瘤細胞中可能通過激活Wnt/β-catenin信號促進腫瘤的惡性增殖和侵襲。這些研究結果為深入理解GBM的發生機制提供了更全面的認識，也為GBM的治療措施提供新的理論參考。但本研究也存在一定的不足，比如細胞及動物實驗方面的證據不夠充足。在后續的研究中，應進一步深入基礎和臨床的研究，以充分闡明RUNX1在GBM中的作用和分子機制。