結核分枝桿菌感染宿主相關生物標志物研究進展

曹景新 綜述，李 磊 審校

(西藏大學附屬阜康醫院：1.呼吸內科；2.實驗室，西藏 拉薩 850000)

根據世界衛生組織(WHO)發布的2018年全球結核病報告顯示，估計全球23%的人口(約17億)存在潛伏結核感染；2017年，全球范圍內約有1 010萬例結核病新發病例，其中男580萬例，女320萬例；兒童100萬例，結核病死亡率約為16%(死亡人數約160萬)[1]。我國結核病患者數占全球結核病患者數的9%，是結核病第二高負擔國家，2017年估算我國結核病新發患者數為88.9萬例，死亡人數約為3.7萬例[1]。盡管許多國家已常規接種卡介苗，但該疫苗主要對兒童播散性結核病有效，對成人的療效仍存在較大爭議[2]。為了實現對結核病的全球控制，最重要的是開發有效的新型疫苗和縮短療程的新型藥物，同時，亦迫切需要開發一種低成本、微創、非痰、高度敏感和特異的結核病檢測方法，其最好采取易于獲取的生物樣本，如血液或尿液。另外，通過在治療早期和治療結束時能指示有效治療的生物標志物，預測復發，可以極大地改善結核病臨床預后。結核病相關生物標志物可分為結核分枝桿菌相關生物標志物和結核分枝桿菌感染宿主產生的生物標志物，本文主要針對后者的一些最新研究進展進行綜述，特別是對活動性結核和潛伏性結核可進行診斷或鑒別診斷，以及在結核病治療中可進行效果監測的生物標志物。

1 宿主抗體對結核分枝桿菌抗原的應答

感染和免疫力似一枚硬幣的兩面，當結核分枝桿菌感染時，必然會激活宿主的免疫反應，導致宿主生物標志物的變化。宿主產生的病原體特異性抗體是診斷病原體常用的生物標記物，主要優勢為操作簡單、價格低廉，也可用于醫療保健。截至目前，針對結核分枝桿菌抗原[如結核菌素、人早期分泌抗原靶6抗體(ESAT-6)、人結核分枝桿菌(CFP-10)和熱休克蛋白]的特異性抗體已被廣泛研究[3]。但是，上述檢測方法表現出的靈敏度(14%～85%)和特異度(53.0%～98.7%)不佳[4-5]。同時，一些結核分枝桿菌抗原，比如ESAT-6和CFP-10不存在于卡介苗菌株的基因組中，因此檢測這些抗原的特異性免疫反應可以區分結核分枝桿菌感染與疫苗接種反應[6]。

近年來，幾種高抗原性結核分枝桿菌抗原(如Rv0310c-E和Rv1255c-E)已被證明可用于診斷，其靈敏度和特異度明顯升高。LUO等[7]研究結果表明，Rv0310c-E和Rv1255c-E特異性抗體IgG用于診斷結核分枝桿菌的敏感度和特異度[受試者工作曲線下面積(AUC)值分別為0.800和0.808]高于ESAT-6和CFP-10(AUC值分別為0.665和0.623)。而LPEZ-RAMOS等[8]研究表明，抗結核分枝桿菌抗原P12037抗體聯合sCD14診斷活動性肺結核的敏感度和特異度分別為92%和91%。另有研究發現，抗結核分枝桿菌抗原的抗體，如PPE17和MDP-1可以區分潛伏性結核病患者和活動性結核病患者[9-10]。MAEKURA等[10]研究表明，抗結核治療后MDP-1抗體持續升高可能與治療結束后復發有關，認為MDP-1是一個潛在的治療監測標志物。但也有研究發現兒童對結核分枝桿菌抗原的抗體反應普遍較低[4]。

2 宿主細胞因子對結核分枝桿菌抗原的應答

相對于抗體反應而言，針對結核分枝桿菌特異性抗原的細胞免疫反應具有更好的一致性。結核菌素皮膚試驗(TST)已被廣泛用于診斷活動性結核和潛伏性結核，但由于交叉反應，該試驗不能區分結核分枝桿菌感染、其他非結核分枝桿菌感染或卡介苗接種后反應，同時，TST在免疫受損患者中的敏感性下降明顯。受結核分枝桿菌特異性抗原刺激，T細胞分泌干擾素-γ(IFN-γ)，其可提示過去或當前感染結核分枝桿菌。近年來，IFN-γ釋放試驗(IGRA)已成為結核病診斷中較受歡迎的檢測方法，IGRA檢測的是結核分枝桿菌特異性抗原，如ESAT-6和CFP-10體外刺激全血后IFN-γ的產生。IGRA有2種檢測方式，一種是基于ELISA法的QuantiFERON-TB Gold(QFT)檢測，另一種是基于酶聯免疫斑點法(ELISPOT)的T-Spot檢測。相比之下，T-Spot檢測活動性結核的靈敏度(91.0%)比QFT的靈敏度(80.2%)更高[11]?？傮w而言，IGRA比TST具有更高的敏感度和特異度，同時，IGRA受人類免疫缺陷病毒(HIV)感染狀況的影響較TST小[12]。另有研究發現，從結核病特定部位(如胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液和腦脊液)分離的外周血單核細胞進行IGRA檢測具有很高的敏感度(90%)和特異度(100%)[13]。活動性結核病患者的IGRA反應一般比潛伏性結核病者更明顯，但IGRA不宜適用于活動性結核和潛伏性結核的鑒別診斷，因IGRA中應用的抗原ESAT-6和CFP-10是結核分枝桿菌的分泌蛋白，容易在活動性感染期間出現[14]。ARROYO等[15]研究表明，在IGRA檢測中采用潛伏期相關抗原，即休眠生存調節子(DosR)和促進復活因子(Rpf)更有益于鑒別結核病活動與否，DosR蛋白Rv2029c和Rpf蛋白Rv2389c被證明可以鑒別活動性結核和潛伏性結核，其敏感度分別為90%和85%。鑒于IGRA的敏感度和特異度，該檢測也被建議用作治療監測工具。KANEKO等[16]研究顯示，治療結束時IGRA陽性的患者出現結核復活，而IGRA陰性的患者在兩年隨訪中沒有出現結核復活。

IGRA作為體外刺激試驗的一個優點是同一試管可以通過多重陣列或流式細胞術重復研究其他生物標記物，以獲得可能區分結核病不同階段的生物學特征。IFN-γ下游的IP-10，已被證明是一個潛力很大的生物標記物。研究顯示，未刺激的輸卵管中血漿IP-10水平的升高與活動性結核有關[17]。IP-10不僅與血液中的IFN-γ一樣敏感，而且還能在患有活動性結核的兒童和成人的尿液中進行IP-10檢測，使得樣本收集更加容易。此外，與IFN-γ不同的是，IP-10受HIV狀態的影響較小。上述優點使IP-10成為一種較可靠的生物標志物。

目前，已有多項研究在血漿上應用多重細胞因子微珠陣列來區分活動性結核和潛伏性結核，這些研究分別應用了5～15個生物標志物的組合進行分析，其鑒別敏感度為82.3%～96.7%[18-20]。其中，IFN-γ和IP-10是這些研究中最常用的生物標記物。LUO等[21]通過對38個細胞因子的篩選研究發現，結合應用嗜酸性粒細胞趨化因子、CCL22和MCP-1這3種細胞因子能鑒別活動性結核和潛伏性結核，敏感度和特異度分別為87.8%和91.8%。與抗結核治療成功與否相關的潛在生物標志物還包括IL-6、MCP-1、VEGF、血清淀粉樣蛋白、IL-11受體拮抗劑和α2-抗纖溶酶等[22-23]，這些生物標記物的具體情況還需要進一步的研究評估和驗證。

3 宿主對結核分枝桿菌抗原的細胞免疫應答

流式細胞術是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術，可以用來分析不同種群中單個細胞的特征。當結核分枝桿菌抗原暴露后，CD4+和CD8+T細胞經歷幾個階段的分化，從幼稚T細胞發展到中央記憶T細胞、效應記憶T細胞，最后到終末分化效應記憶T細胞。同時，抗原暴露越多，T細胞分化就越快?；谏鲜鲈?，人們也關注與結核病分期相關的T細胞的功能特征(即亞群及其細胞因子的合成)。CD69是一種共刺激受體和早期激活標志物，CD4+CD69+IFN-γ+T細胞水平升高與早期活動性結核病或近期的結核感染有關[24-25]。同樣，CD137是一種共刺激受體，負責維持T細胞的有效激活、增殖和存活，其出現頻率也被證明與活動性結核有關[26]。

MILLINGTON等[27]研究發現，多功能的CD4+IFN-γ+IL-2+TNF-α+T細胞主要見于活動性結核病患者，而CD4+IL-2+IFN-γ+T細胞和CD4+IFN-γ+T細胞見于潛伏性結核病患者。同時，也有研究表明，非活動性結核(包括潛伏性結核、卡介苗接種或治療期結核病)主要與CD4+IFN-γ+IL-2+效應記憶T細胞和CD4+IL-2+效應記憶T細胞有關,而活動性結核主要與CD4+IFN-γ+終末分化效應記憶T細胞有關[28]。AHMED等[29]研究發現，活動性結核與CD38+CD27low的頻率增加相關，而潛伏性結核與CD38-CD27high的頻率增加相關。CD27是TNF-α受體超家族成員之一，在鑒別活動性結核和潛伏性結核中有一定的應用價值。研究發現，CD27和結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞兩者與結核分枝桿菌抗原/結核分枝桿菌負荷相關，因此可以作為監測治療進展的生物標志物[30]。其他T細胞亞群，如IL-10+Th17 T細胞在潛伏性結核病患者中顯著升高，而在DosR刺激下，活動性結核病患者IFN-γ+Th17 T細胞顯著升高[31]。除了T細胞外，樹突狀細胞在抗菌免疫方面也發揮著重要作用。有研究發現，BDCA3+樹突狀細胞和CD123+樹突狀細胞的占比在活動性結核病患者中明顯減少；而在潛伏性結核病患者中該亞型的占比明顯增加[32]。

其他表面標志物，如CD38、HLA-DR、Ki-67和骨髓來源的抑制性細胞(MDSCs)的含量被認為可作為監測治療效果的生物標志物[33]。AHMED等[29]研究發現抗結核治療9周后，T細胞表面CD38、HLA-DR等免疫激活標志物的表達明顯降低。CACCAMO等[34]抗結核治療的隨訪研究顯示，結核病感染明顯好轉的患者表現出從CD4+IFN-γ+終末分化效應記憶T細胞向CD4+IFN-γ+IL-2+效應記憶T細胞的轉變。在一項關于活動性結核病抗結核治療的縱向前瞻性研究中，以抗結核治療開始后71 d為界點，將患者分為兩組：71 d內痰培養轉陰者為快速反應組，痰培養轉陰晚于71 d者為慢反應組，結果發現Treg基因在慢應答者中的頻率較高，并且Treg基因可以預測培養轉陰的時間，其敏感度為81%，特異度為85%[35]。

4 組學方法在生物標志物研究中的應用前景

組學即基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學等的統稱。這些組學方法不僅被用于結核病診斷、監測治療效果、預測治療結果，而且還被用于提高對結核病發病機制的探索。

一項基因組學研究中，能編碼IFN誘導核蛋白的基因Sp110，對rs7580900、rs7580912、rs9061、rs11556887、rs2241525這5個單核苷酸多態性進行分析，結果發現rs9061與潛伏性結核的易感性呈顯著相關[36]。進一步的研究表明，攜帶該單核苷酸多態性的個體血漿TNF-α水平有所降低[37]。一項轉錄組學研究發現，全血中有393個轉錄本表征活動性結核病，另有86個轉錄本，能將結核病與其他感染區分開,且通過分析發現活動性結核病的特征主要由中性粒細胞驅動的IFN誘導基因組成，包括IFN-γ和Ⅰ型IFN-αβ信號[38]。另有研究提出，轉錄圖譜能夠區分活動性結核和潛伏性結核[39]。細胞毒性基因轉錄本也可用于結核病預后評估，以預測結核病復發[40]。

轉錄組學的研究主要針對mRNA表達譜的研究，近年對mRNA的非編碼區的研究關注與日俱增。雖然這些非編碼RNA不編碼任何蛋白質，但它們具有一定的調節功能，因此可能會因結核病的不同階段而改變。MIOTTO等[41]通過比較兒童結核、成人活動性肺結核、活動性肺外結核、結核/HIV混合感染和潛伏性結核病患者的microRNA(miRNA)圖譜，成功地確定了結核感染常見的15種miRNA特征，其敏感度和特異度分別為82%和77%。circRNA是一類具有閉合環狀結構的非編碼RNA分子，其高度抵抗核糖核酸酶的降解，因此在細胞中含量豐富且持續時間長。FU等[42]研究發現，結核感染患者中有171個circRNA調控異常，circRNA_103017、circRNA_059914、circRNA_101128升高最明顯，而circRNA_062400下降，推測circRNA_103017對結核病的診斷有潛在價值，其次為circRNA_059914和circRNA_101128。CHAKRABARTY等[43]鑒定了幾種miRNA，發現兩種來自人類的miRNA(hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-125b-5p)和一種來自結核分枝桿菌的miRNA(MTB-miR5)在活動性結核患者中有明顯增加。miRNA也被用來鑒別活動性結核和潛伏性結核。LYU等[44]通過研究250個miRNAs發現，hsa-let-7e-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-140-5p在潛伏性結核病患者中呈差異表達，而hsa-miR-1246、hsa-miR-2110、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-28-3p和hsa-miR-193b-5p在活動性結核病患者中存在差異表達。

利用蛋白質組芯片方法，對4 262個結核分枝桿菌抗原進行篩選，發現活動性結核病患者有152個結核分枝桿菌抗原的免疫球蛋白G水平比潛伏性結核病患者呈明顯提升，且進一步分析表明，Rv2031c、Rv1408和Rv2421c能夠區分活動性結核和潛伏性結核[45]。由于組學方法能夠為結核病發生和發展的機制提供更全面的闡述，因此其在預測結核病治療結果上具有更高準確性。DUFFY等[46]為了提高對結核病進展的了解，通過結合轉錄組學、代謝組學和通路分析，確定了一組新的免疫代謝信號,涉及皮質醇、色氨酸、谷胱甘肽和tRNA酰化網絡，該信號通路與潛伏性結核向活動性結核進展有關。由于結核分枝桿菌特異性免疫反應在人類群體中可能不是同質的，可能受到HIV混合感染、遺傳和外源環境因素的影響。所以，組學研究中的變量數量通常比樣本量大得多，進而檢測合適的生物標志物的統計難度大幅提升。

5 小 結

結核病的診斷及治療監測對臨床決策至關重要，宿主生物標志物對此起著重要作用，但目前臨床上可用于結核病檢測的生物標志物不是最理想的。宿主對結核分枝桿菌抗原產生的特異性抗體反應普遍較低，但針對結核分枝桿菌特異性抗原的細胞免疫反應具有更好的一致性。IGRA比TST具有更高的敏感度和特異度，IGRA已成為結核病診斷中較受歡迎的檢測方法。結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞與結核分枝桿菌抗原負荷相關，因此可作為監測治療效果的生物標志物。基于組學的技術能夠為疾病機制提供更全面的闡述，在預測結核病預后方面也更準確，但仍需進一步探索研究。