Lnc RNA TUC338 影響人類宮頸癌細(xì)胞的蛋白組學(xué)分析

蔣漪樺，朱 宇，杜洪靈，秦錦龍，劉 曄，宋君雅，蔡驍垚，金 姝1，，4

（1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200060；3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200060；4.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200060）

長鏈非編碼RNA（Lnc RNA）是一類讀碼框之外的RNA，近年來Lnc RNA 被發(fā)現(xiàn)存在多種生物功能，在癌癥、免疫、神經(jīng)、心血管等多種系統(tǒng)中存在重要作用，尤其在癌癥領(lǐng)域的研究成為熱點(diǎn)。在腫瘤的診斷、藥物治療的靶點(diǎn)、判斷腫瘤預(yù)后等方面均取得進(jìn)展。Lnc RNA TUC 338 長度為590 bp，位于人類第12 對染色體長臂上。對于Lnc RNA TUC 338 的研究較少，已發(fā)現(xiàn)在肺癌[1]、膀胱癌[2]和食管癌[3]中，Lnc RNA TUC338 均通過不同機(jī)制促進(jìn)癌癥發(fā)展，提示其為一種癌基因。而宮頸癌作為女性生殖系統(tǒng)的三大腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性的生理、心理健康[4]，一定程度上也影響了兩性關(guān)系的和諧[5]。Lnc RNA TUC 338 在人類宮頸癌中的相關(guān)研究較少，本研究探索了Lnc RNA TUC 338 在宮頸癌的發(fā)展中的作用及其影響宮頸癌細(xì)胞的發(fā)展的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人類宮頸癌細(xì)胞Hela 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司（北京）；磷酸鹽緩沖液（PBS），購于索萊寶科技有限公司（北京）；DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Ladder H1（100-1000 bp），購于生工生物工程股份有限公司（上海）；RNAfast 200 總RNA 提取試劑盒，購于飛捷生物技術(shù)有限公司（上海）；FastKing RT Kit 試劑盒、FastFire qPCR PreMix試劑盒購于天根生化科技有限公司（北京）；引物合成：生工生物工程股份有限公司（上海）；病毒包裝：維諾賽生物技術(shù)有限公司（武漢）。

1.2 儀器 離心機(jī)：Eppendorf 離心機(jī)Centrifuge 5418；顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；熒光顯微鏡：Nikon ECLIPSE Ti 熒光顯微鏡；PCR 儀：BIORAD My Cycler；酶標(biāo)儀：BioTek Synergy H1 全功能酶標(biāo)儀；電泳儀：Tanon EPS 300 電泳儀；電泳設(shè)：Bio-Rad SDS-PAGE 電泳設(shè)備；凝膠成像分析系統(tǒng)：Tanon 1600。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將HELA 細(xì)胞以每孔1×106個(gè)置于6 孔板中，每孔加入濃度10%FBS 的DMEM 2 ml，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每48 h 進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時(shí)，按慢病毒使用說明書以脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染慢病毒，將HELA 細(xì)胞分為兩組：轉(zhuǎn)染rLVhTUC338-ZsGreen-Puro 慢病毒（實(shí)驗(yàn)組，以下簡稱TUC338 組）、轉(zhuǎn)染rLV-ZsGreen-Puro 對照組病毒（對照組，以下簡稱rLV 組），轉(zhuǎn)染48 h 后以2 μg/ml的比例加入嘌呤霉素殺滅未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h 后再殺滅1 次，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%后進(jìn)行以下各種實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Lnc RNA TUC338 擴(kuò)增 待細(xì)胞基本鋪滿板底時(shí)按照RNAfast 200 總RNA 提取試劑盒的說明書提取細(xì)胞RNA，按照天根FastKing RT Kit（with gDNase）說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照天根FastFire qPCR PreMix（SYBR Green）試劑盒說明書，將cDNA 目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，條件為：94 ℃3 min，94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃30 s循環(huán)39 次，72 ℃10 min 退火。TUC338 引物：Forward：TCAACTTAATCCCACACTGACC，Reverse：GAGCCTTGGAGACTGAACATC。以β-actin 為內(nèi)參照，β -actin 引 物：Forward：CTCGCCTTTGCCGATCC，Reverse：TCTCCATGTCGTCCCAGTTG。將擴(kuò)增的目的基因分別進(jìn)行蛋白電泳，以1000 bpMarker為參照。

1.3.3 細(xì)胞送樣及蛋白測序 將每組細(xì)胞樣本分為3 個(gè)組別，送至北京諾禾致源技術(shù)公司，通過非標(biāo)記定量方法（Label-free）對蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.4 蛋白質(zhì)譜分析 通過非標(biāo)記定量方法（Labelfree）對2 組細(xì)胞的蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行定量、差異和富集分析。

1.3.5 TUC338 對蛋白基因本體功能（GO）的影響分析 分析基因本體功能（GeneOntology，GO）（www.geneontology.org），包括細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）、生物過程（BP）。

1.3.6 KEGG 分析 通過Pathway 的主要公共數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）分析出已確定蛋白質(zhì)參與的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生化代謝途徑。

1.3.7 蛋白結(jié)構(gòu)域分析 利用Interproscan 軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，數(shù)據(jù)庫包括Pfam、ProDom、SMART 等。

1.3.8 亞細(xì)胞定位分析 采用Cell-mPLOC 2.0 網(wǎng)站對測出的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞的定位，亞細(xì)胞包括細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞膜和胞漿等。

1.3.9 蛋白互作分析 對鑒定到的蛋白進(jìn)行蛋白互作分析，應(yīng)用數(shù)據(jù)庫http://string-db.org/（StringDB 蛋白互作數(shù)據(jù)庫）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0 軟件對所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)TUC338 穩(wěn)定細(xì)胞系和總蛋白鑒定 已篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系：熒光顯微鏡下見兩組細(xì)胞熒光顯色均為100%，慢病毒感染成功，見圖1A；Lnc RNA TUC338 在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)：經(jīng)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，可見相較于對照組，實(shí)驗(yàn)組中的Lnc RNA TUC338 基因顯著過表達(dá)，見圖1B；總蛋白鑒定：對提取到的蛋白進(jìn)行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，兩組均顯示較多的蛋白條帶，見圖1C，提取蛋白成功。

圖1 過表達(dá)TUC338 穩(wěn)定細(xì)胞系和總蛋白鑒定

2.2 蛋白質(zhì)譜分析

2.2.1 差異蛋白分析 蛋白定量分析共檢測到4323個(gè)蛋白。蛋白差異分析顯示：與rLV 組比較，在TUC338 組中下調(diào)的蛋白有194 個(gè)，上調(diào)的蛋白有225 個(gè)。以火山圖（圖2A）和熱圖（圖2B）表示。其中，重要的下調(diào)蛋白有：LAMB1、HNRNPH3、COX2、FADS2、GPATCH4、CAV1、AHNAK、PFKM、MAVS、ANP32E 等。重要的上調(diào)蛋白有：EPPK1、ITPR1、AKR1C2、MFF、PTGS2、PNPLA6、AKR1B1、ITGA1、PTGFRN、TGM2 等。

圖2 TUC338 影響宮頸癌細(xì)胞中蛋白差異表達(dá)的分析

2.2.2 TUC338 對蛋白基因本體功能的影響 GO 富集注釋結(jié)果柱狀圖顯示，BP 前3 位為：膀胱介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)（vesicle-mediated transport）29 個(gè)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)（transport）45 個(gè)蛋白、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)（intracellular protein transport）45 個(gè)蛋白；MF 前3 位為：鈣離子結(jié)合（calcium ion binding）79 個(gè)蛋白、蛋白激酶活性（protein kinase activity）85 個(gè)蛋白；CC 前3 位為：細(xì)胞外區(qū)域組分（extracellular region）15 個(gè)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（endoplasmic reticulum）17 個(gè)蛋白，見圖3A；與rLV 組比較，rLV-TUC338 組中顯著下調(diào)BP，包括：真空轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞組分組裝、自噬體組裝等6 組（P＜0.05）。MF 包括：磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，醇基作為受體、細(xì)胞色素-c 氧化酶活性、激酶活性等7 組。無顯著的下調(diào)CC 蛋白見圖3B。與rLV 組比較，rLVTUC338 組中顯著的上調(diào)BP 包括：細(xì)胞鐵離子穩(wěn)態(tài)、脂代謝過程、磷脂分解代謝過程等9 組。MF 包括：三價(jià)鐵結(jié)合、內(nèi)肽酶抑制劑活性、蛋白谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性等9 組。CC 包括：細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞外空間、細(xì)胞骨架等5 組，見圖3C。

圖3 基因本體功能分析

圖3 基因本體功能分析（續(xù)）

2.2.3 KEGG 分析 KEGG 富集注釋結(jié)果柱狀圖顯示，共注釋到了包括：細(xì)胞過程，轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（Transport and catabolism）313 個(gè)蛋白、真核生物（Cellular community-eukaryotes）162 個(gè)蛋白、細(xì)胞運(yùn)動（Cell motility）75 個(gè)蛋白等，共44 個(gè)KEGG 途徑。其中，注釋到最多蛋白的途徑為代謝總譜（541 個(gè)蛋白）見圖4A。顯著下調(diào)KEGG 通路有半乳糖代謝（Galactose metabolism）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）等共6 個(gè)（P＜0.05），見圖4B、表1。顯著的上調(diào)KEGG 通路有肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)（Regulation of actin cytoskeleton）等共20 個(gè)，見圖4 C，表2。

表1 KEGG 分析中重要的下調(diào)蛋白

表2 KEGG 分析中重要的上調(diào)蛋白

圖4 KEGG 分析

圖4 KEGG 分析（續(xù)）

2.2.4 蛋白結(jié)構(gòu)域分析 結(jié)構(gòu)域注釋結(jié)果柱狀圖顯示共檢測到含WD40 repeat 結(jié)構(gòu)域（WD40 repeat）等20 個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，見圖5A。rLV 組和rLV-TUC338組中有顯著差異的結(jié)構(gòu)域包括血紅蛋白過氧化酶結(jié)構(gòu)域，動物（Haem peroxidase，animal）等，見圖5B。

圖5 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

2.2.5 亞細(xì)胞定位分析 蛋白亞細(xì)胞定位占比統(tǒng)計(jì)分析顯示，主要亞細(xì)胞成分為：核蛋白（nucleus protein）占34.23%、細(xì)胞質(zhì)蛋白（cytoplasm protein）占16.16%、線粒體蛋白（mitochondrion protein）占14.22%、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白占8.44%；剩余由細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞外蛋白、高爾基體蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、溶酶體蛋白等構(gòu)成，見圖6A。差異蛋白亞細(xì)胞定位占比統(tǒng)計(jì)分析顯示，主要差異亞細(xì)胞成分為：核蛋白（nucleus protein）31 個(gè)，占24.22%、細(xì)胞質(zhì)蛋白（cytoplasm protein）23 個(gè)，占17.97%、細(xì)胞外蛋白（extracell protein）20 個(gè)，占15.62%，見圖6B。

圖6 亞細(xì)胞定位分析

2.2.6 蛋白互作分析 在rLV 組和rLV-TUC338 組中，下調(diào)的互作網(wǎng)主要包括：prot1（P37268）-prot2（O95864）、prot1（Q6FGH9）-prot2（Q13363）等。上調(diào)的互作網(wǎng)主要包括：prot1 （P60520）-prot2（A0A024RBQ5）、prot1（P60520）-prot2（Q06330）等，見圖7。

圖7 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

差異蛋白分析發(fā)現(xiàn)Lnc RNA TUC338 下調(diào)了Hela 細(xì)胞的一些蛋白，從多種途徑抑制腫瘤發(fā)展。其中PFKM 是糖酵解重要調(diào)節(jié)酶之一，負(fù)責(zé)催化6-磷酸果糖磷酸化為1，6-二磷酸果糖。糖代謝是支持腫瘤發(fā)展的重要代謝途徑，PFKM 在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，比如在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）中被確定為靶基因[6]。PFKM 對糖酵解的代謝重編也使乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力提高[7]。在宮頸癌中，PFKM 也存在異常高表達(dá)[8]。另一下調(diào)蛋白ANP32E即酸性核磷蛋白32 家族成員E，是一種組蛋白伴侶，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)。已有研究證實(shí)其與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)[9]；在甲狀腺癌的研究中，ANP32E 上調(diào)激活A(yù)KT-mTOR-HK2 信號通路，增強(qiáng)糖酵解，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖和遷移[10]。這些與PFKM 協(xié)同，均提示Lnc RNA TUC338 可降低糖代謝，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。Lnc RNA TUC338 上調(diào)了一些蛋白，其中透明相關(guān)formin 1（DIAPH1）是一種激動蛋白成核酶，參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，可與紡錘體-微管（MT）高親和力結(jié)合，起到穩(wěn)定染色體的作用[11]。這種作用機(jī)制與紫杉醇相同，且DIAPH1 可協(xié)同紫杉醇穩(wěn)定微管，增加卵巢癌對紫杉醇的藥物敏感性[12]。DIAPH1 的上調(diào)提示Lnc RNA TUC338 通過改變細(xì)胞骨架通路，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，抑制腫瘤進(jìn)展。

GO 分析發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA TUC338 下調(diào)了一些GO，其中重要的下調(diào)BP 為磷酸化。磷酸化途徑中的膜相關(guān)酪氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（PKMYT1）為膜相關(guān)激酶，是WEE 家族的一員，特異性磷酸化絡(luò)氨酸（Tyr）15 和Thr14[13]，絡(luò)氨酸的磷酸化影響代謝酶活性，使腫瘤發(fā)展[14]。另外，PKMYT1 可通過磷酸化并滅活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1，調(diào)控G2/M 期之間的轉(zhuǎn)換，并對DNA 進(jìn)行損傷修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，在多種癌癥中均高表達(dá)[15]。rLV-TUC338 組中重要的下調(diào)MF 為磷酸轉(zhuǎn)移酶活性；其中，絲裂原活化蛋白激酶激酶2（MAP2K2）磷酸化并激活MAPK1/ERK2和MAPK2/ERK3，在MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用，促進(jìn)有絲分裂。通過抑制MAP2K1 及MAP2K2可阻斷該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞增殖[16]。磷酸化及磷酸轉(zhuǎn)移酶活性途徑的下調(diào)，提示Lnc RNA TUC338抑制腫瘤增殖的機(jī)制，可能與抑制磷酸化過程有關(guān)。

KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA TUC338 下調(diào)了一些KEGG 通路。KEGG 中最顯著的下調(diào)信號通路為半乳糖代謝。半乳糖是細(xì)胞代謝中必不可少的單糖，參與多種生物學(xué)功能。目前研究發(fā)現(xiàn)越來越多的疾病涉及半乳糖代謝[17]。半乳糖糖代謝在腫瘤發(fā)展過程中亦起到重要作用。其中磷酸葡萄糖變位酶1（PGM1），具有催化葡萄糖1-磷酸（G-1-P）和葡萄糖6-磷酸（G-6-P）之間互相轉(zhuǎn)化的作用，參與糖原分解及合成，被認(rèn)為是一種癌基因。在肺癌中，葡萄糖剝奪狀態(tài)時(shí)，AMP 活化蛋白激酶（AMPK）作為PGM1 的上游調(diào)控因子，使PGM1 表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)糖酵解，強(qiáng)化腫瘤代謝，促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)展[18]。敲低PGM1可顯著降低糖酵解，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[19]。KEGG 中最顯著的上調(diào)信號通路為肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)。肌動蛋白細(xì)胞骨架有多種生物學(xué)功能，包括維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)[20]、通過氧化還原作用調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的遷移、增殖以及收縮[21]等。肌動蛋白細(xì)胞骨架在腫瘤細(xì)胞中對細(xì)胞遷移能力有很大影響[22]。其中磷脂酰肌醇-5-磷酸4-激酶2 型α（PIP4K2A），涉及磷酸化及細(xì)胞骨架2 個(gè)途徑。在磷酸化途徑中，可磷酸化5-磷酸磷脂酰肌醇，參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞功能，包括增殖、遷移、免疫、物質(zhì)運(yùn)輸及葡萄糖攝取等[23，24]。在細(xì)胞骨架途徑中，可以維持線粒體的結(jié)構(gòu)及功能穩(wěn)態(tài)[25]。有研究顯示[26]，PIP4K2A 為抑癌基因，其在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中負(fù)向調(diào)節(jié)磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信號傳導(dǎo)，降解P85，從而抑制腫瘤生長。上述結(jié)果提示Lnc RNA TUC338 抑制腫瘤增殖，其機(jī)制可能與抑制半乳糖代謝及活化細(xì)胞骨架通路有關(guān)。

綜上所述，Lnc RNA TUC338 改變了人類宮頸癌細(xì)胞的蛋白組學(xué)，是宮頸癌的抑癌基因。主要通過糖代謝、磷酸化、細(xì)胞骨架途徑實(shí)現(xiàn)其抑癌作用。

致謝：感謝上海同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)院博導(dǎo)、教授陸東東對本次研究的技術(shù)指導(dǎo)與論文撰寫指導(dǎo)。