水貂阿留申病碘凝集檢測技術

李鑫，劉進軍，張偉濤，韓學良，劉潔，楊丹

（1.石家莊市農林科學研究院/河北省毛皮動物養殖技術創新中心，河北石家莊 050041；2.河北省畜牧總站，河北石家莊 050035）

水貂阿留申病(AMD)又稱漿細胞增多癥(plas-macytasis)，是由主要侵害水貂免疫細胞的阿留申病毒(AMDV)感染所致，導致水貂自身免疫系統紊亂并引發強烈自身免疫反應的慢性傳染性疾病[1]。水貂阿留申病毒（Aleutianmink diseasevirus，AMDV）屬于細小病毒科細小病毒亞科阿留申病毒屬，是影響水貂養殖業的重要傳染病之一[2]。目前，該病無有效的疫苗和藥物能夠起到預防和治療作用，只能通過規模化的精準檢測逐年將陽性貂淘汰來抑制病毒的傳播。

阿留申病的檢測方法很多，主要分成兩大類：AMDV基因檢測和血清學抗體檢測。AMDV基因檢測包括傳統PCR檢測、實時熒光定量PCR檢測、直接PCR檢測、環介導等溫擴增檢測；血清學抗體檢測包括碘凝集試驗法、對流免疫電泳法、膠體金試紙條法、斑點酶聯免疫法、酶聯免疫吸附試驗法。其中碘凝集試驗法被廣泛用于現場檢測，雖為非特異性檢測，但在檢測過程中能夠快速檢出動物是否患有慢性疫病[3]。該法相比于其他檢測法，操作簡便、成本低、不需要昂貴的儀器投入，因此適合水貂養殖場阿留申病的初篩，被廣泛用于現場檢測。

1 阿留申病的危害

水貂阿留申病首次發現是在20世紀40年代后期，在美國發現了患有阿留申病的水貂，其全身被毛呈暗灰色，顏色表現與阿留申狐貍相似[4]。水貂被感染后，病毒在體內復制，使巨噬細胞功能素亂，漿細胞增多，免疫球蛋白過度產生及免疫復合物在組織內沉積出現超敏和自身免疫現象，從而導致抗原抗體復合物沉積造成組織損傷，病貂最終死于尿毒癥和繼發感染[5]，嚴重影響水貂繁殖機能和毛皮質量，造成公貂配種能力下降，母貂空懷、流產、死胎及感染子代等，給養貂業造成極其嚴重的經濟損失，為水貂三大疫病之一。我國每年因阿留申病造成的經濟損失初步估計超過50億元。該病普遍存在，感染率為30%～40%，有的高達80%～90%。

2 碘凝集檢測技術

2.1 材料

玻璃板（10厘米×10厘米）、牙簽、10微升移液器、毛細采血管（20微升肝素鈉抗凝的毛細玻璃管，長度75毫米，直徑1.55毫米）、標簽紙、記號筆、毛細管盒、指甲刀、工業橡皮泥。

2.2 樣品采集

每年結合選種工作，對養殖場內水貂群進行3次阿留申病檢測。第一次在分窩初選時，第二次是在9～11月份終選時，第三次是在翌年2月份配種前，采集水貂血液作為檢測樣本進行碘凝集檢測，將阿留申陽性水貂檢測出并淘汰。

2.2.1水貂編號

由于毛細采血管比較細，無法在采血管上進行編號，只能在采血管盒上編號，需要每個血液樣品與相應的水貂籠進行一一對應，如果對應不上，無法定位阿留申病陽性水貂，檢測就失去意義。具體方法是水貂以12為一組與毛細管盒一一對應進行編號，編號方法為棟舍號+籠號。

2.2.2水貂保定

保定者戴上棉手套從籠內抓取水貂，在該籠的產箱上進行保定。

2.2.3血液采集

術者一手固定水貂后爪，另一手取滅菌的指甲刀在趾甲與趾墊的結合處剪斷趾甲，棄去第一滴血，然后將毛細采血管一端輕觸血滴，待血流入管的2/3處，用手指堵住毛細采血管的上端，另一端垂直插入工業用橡皮泥進行封口。

2.2.4血樣保存

采血管按照編號順序放入毛細管盒中，將毛細管封口端朝下豎直放置，如果不能及時檢測，宜放置在4℃冰箱中保存。

2.2.5血漿制備

采集的血樣可用毛細采血管專用離心機2500～3000轉/分鐘離心10分鐘也可在室溫或4℃冰箱內放置過夜析出血漿。溶血的血樣應棄去，重新采集。

2.3 碘凝集試驗

2.3.1配制試劑

稱取碘化鉀4克、碘顆粒2克、蒸餾水30毫升，先將碘化鉀用少量的蒸餾水溶解于玻璃燒杯中，再加入碘顆粒，震蕩使其充分溶解，最后加入剩余的蒸餾水，充分混勻，放置于棕色瓶，靜置24小時即可使用，4℃冰箱保存。

2.3.2操作方法

將干凈的玻璃板平放，劃成24個方格，橫數4個格，縱數6個格，每格2.5厘米×1.5厘米，用砂輪輕劃毛細采血管血漿與紅細胞界面，掰斷毛細管，用10微升的移液器將血漿吹出，按順序滴到玻璃方格內，每滴血漿旁加10微升的碘凝集試劑，然后用牙簽將二者混勻，每個血樣更換一個牙簽。

2.3.3結果判定

混勻后，1分鐘內進行觀察，結果判定見下表。

碘凝集試驗結果判定

2.3.4試驗記錄

將試驗過程中檢測的血液樣本編號與檢測結果一一對應記錄下來，還要將檢測時間、檢測人等信息一并記錄。

3 凈化措施

對檢出的陽性水貂進行嚴格的隔離淘汰處理，陽性貂用過的籠具進行嚴格消毒，淘汰的陽性水貂可以轉到皮獸養殖場進行飼養取皮。阿留申病毒能夠垂直傳播，因此陽性貂產的仔貂會攜帶病毒，不能留作種用。阿留申陽性貂與陰性貂要分開飼養，建議將陽性貂養在陰性貂的下分口方向，配種期間禁止陰性貂與陽性貂交配，籠舍、用具、飼養人員都要嚴格區分，避免交叉感染。將阿留申病毒檢測作為每年的重點工作，通過碘凝集檢測及時淘汰陽性貂，逐年提高陰性貂比例，最終達到凈化的目的。