不同產地豆豉中納豆菌株的篩選鑒定及耐受性的研究

劉紫嫣 孫于寒 彭浩 王夢姣

(陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西 漢中 723000)

前言

納豆自唐朝傳入日本,是一種由豆類經過納豆菌發(fā)酵而成的食品,其特點為本身帶有一定的黏性和較臭的氣味以及微甜的味道[1]。一般為偏中生、孢囊不膨大、具有鞭毛,對溫度、pH值以及膽鹽等有較高的耐受性[2]。納豆激酶是由納豆芽孢桿菌分泌產生的一種具有纖溶作用的絲氨酸蛋白酶[3],在保健產品開發(fā)上具有良好的應用前景。

本研究以我國云南、貴州、陜西和湖南等不同產地的豆豉為研究材料，對其中的納豆菌株進行篩選鑒定，并探究了其對溫度、pH的耐受性，結果獲得4株高產納豆激酶，且對溫度和pH具有高耐受性的納豆芽孢桿菌，以期為納豆產品的開發(fā)提供借鑒。以期為解決上述問題提供優(yōu)質菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

云南豆豉，云南易門山里香食品有限責任公司；貴州豆豉，貴州華瑞名鼎食品有限公司；陜西豆豉，市售；湖南豆豉，湖南華越食品有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

1.1.2.1 NBP培養(yǎng)基

蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、瓊脂20.0g、去離子水1.0L。

1.1.2.2 脫脂奶培養(yǎng)基

10%脫脂奶、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、2%瓊脂，pH 7.2～7.4。

1.1.2.3 液體種子培養(yǎng)基

不添加瓊脂的NBP培養(yǎng)基。

1.1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

胰蛋白胨20.0g、Na2HPO45.0g、NaH2PO41.5g、葡萄糖20.0g、CaCl20.2g、MgSO40.3g、去離子水1.0L。

1.2 方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌的分離純化

將云南、貴州、陜西、湖南4地豆豉25.0g加入裝有225mL的均質袋中(均質壓力為200MPa)，均質好的菌懸液進行10-4、10-5、10-63個梯度稀釋。用移液器取10-4、10-5、10-6進行梯度稀釋液各200μL在NBP平板上，于37℃倒置培養(yǎng)48h[6]；采用連續(xù)劃線的方法進行純化，并將純化后的菌株進行低溫保藏[7]。

1.2.2 納豆菌的篩選

制備(濃度)納豆菌懸液，吸取20μL置于脫脂奶培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)48h。分別測定透明圈直徑和菌落直徑，計算R(透明圈直徑/菌落直徑),求出R平均值。每組處理均設置3個重復。選取R平均值較大的菌株進行下一步實驗。

1.2.3 納豆激酶活力測定

用Folin-酚法測定初篩到的10株菌株的酶活力，選取納豆激酶活力最高的菌株作為復篩的目標菌株。

1.2.4 種子液的制備

挑取試管斜面納豆菌至液體種子培養(yǎng)基(裝液量為50/250mL)，并在37℃，180r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)48h[8]，備用。

1.2.5 粗酶液的制備

將納豆菌液體種以2%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，并在37℃，180r·min-1的條件下培養(yǎng)48h。離心(10000r·min-1，30min)獲得含有納豆激酶的發(fā)酵上清液，備用。

1.2.6 納豆激酶的活性測定

1.2.6.1 酪氨酸標準曲線的制作

取7支試管，在680nm的波長下分別測定各管的吸光度。以OD680值為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線[9]。見表1(1號試管為不含酪氨酸的空白對照)。

表1 酪氨酸標準曲線

1.2.6.2 納豆激酶酚法酶活測定

將1%的酪蛋白溶液放入37%的水浴中預熱5～10min；取3支試管編號為1、2、3(1為空白對照，2、3為平行樣品)，在3支試管中加入1%的酪蛋白溶液1.0mL,于37%恒溫水浴下預熱5～10min。在試管1中加入10%三氯乙酸溶液4mL，在試管2、3中加入1%的待測酶液1.0mL。將試管1、2、3置于37℃的恒溫水浴10～15min；向3支試管中加入10%三氯乙酸溶液4mL。靜置，離心15min(4000r·min-1)。離心結束后取1.0mL的上清液于另外3支試管中，加入5.0mL的0.55mol·L-1Na2CO3溶液和福林酚試劑1.0mL,進行顯色反應[10]；用酶標儀測定680nm樣品吸光度。先用空白調零，再分別測定樣品平行1、2、3的吸光度，取平均值為各樣品的吸光度。

1.2.7 納豆芽孢桿菌的鑒定

采用《伯杰細菌鑒定手冊》[11]第8版對分離得到的菌株進行項生理生化鑒定實驗。

1.2.8 納豆激酶高產菌株的特性研究

1.2.8.1 對溫度的耐受性

將菌株用基礎種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,取發(fā)酵液1mL,采用無菌操作,稀釋到一定的倍數(shù),分別置于溫度92℃和96℃中水浴10min、15min和20min,流水冷卻,以室溫下未經水浴的菌株作為對照,采用平板計數(shù)法計算水浴后菌株的存活率,據(jù)此判斷其對溫度的耐受性[12]。

1.2.8.2 對pH值的耐受性

配制2種不同的pH緩沖液，取不同的量配成不同pH的溶液，其中,A液為0.1mol·L-1的檸檬酸溶液，B液為0.2mol·L-1的磷酸氫二鈉。將菌株接種于基礎種子培養(yǎng)基,在溫度37℃,轉速150r·min-1下振蕩培養(yǎng)24h,使菌種的OD600值控制在1.5～1.6,并將此種子液保存?zhèn)溆肹13]。將此種子液以一定量接種于具有不同pH值的基礎種子培養(yǎng)基中,于溫度37℃下培養(yǎng)45min,取培養(yǎng)液1mL,經適當稀釋后,涂布平板計數(shù),計算相對存活率,以此判斷其對pH值的耐受性。

2 結果與討論

2.1 納豆芽孢桿菌的分離純化結果

根據(jù)納豆芽孢桿菌的特性，將4個產地的豆豉樣品進行稀釋涂布培養(yǎng)后，分離出了30株菌落形態(tài)不同的菌株。云南5株，編號為N1～N5；貴州10株，編號為G1～G10；陜西8株，編號為S1～S8；湖南7株，編號為H1～H7。菌落呈白色或微黃色，濕潤、黏稠，不透明或微透明，表面褶皺，具有芽孢桿菌的形態(tài)特征。

2.2 產納豆激酶菌株的篩選結果

在牛肉膏培養(yǎng)基進行畫線培養(yǎng)，分離出單一的菌落,并在脫脂奶培養(yǎng)基平板上點樣,結果見圖1。測量透明圈直徑和菌落直徑,計算比值R(R=透明圈直徑/菌落直徑)。

從圖1可知，N2、G1、S3、H3的R值最大，可初步判斷其產酶能力最強。

圖1 篩選結果

2.3 納豆芽孢桿菌菌株復篩結果

2.3.1 酪氨酸標準曲線

按1.2.3的方法，測得波長680nm下各試管的吸光度，見表2。根據(jù)表2所得數(shù)據(jù)，繪制以吸光度為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標的標準曲線[14]，如圖2。(根據(jù)回歸方程計算吸光常數(shù)K，即吸光度為1時酪氨酸μg數(shù))。根據(jù)圖2可知，K=72.97。

表2 酪氨酸標準曲線

圖2 酪氨酸標準曲線

2.3.2 納豆激酶活力值

酶活力定義：在37℃，pH 7.4的條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需酶量為一個酶活力單位。根據(jù)所述方法測得各菌株的吸光度，并代入公式計算各菌株的酶活力，結果見表3。

酶活力計算公式：

酶活力(U·mL-1)=[A/(T×W)]×K×V×N

式中，A為平均吸光度；T為反應時間10min；W為反應酶液體積1mL；K為吸光常數(shù)72.97；V為反應液總體積5mL；N為稀釋倍數(shù)100。

表3 初篩菌株酶活力結果

根據(jù)目前國內報道的納豆激酶活性大多為600～900U·mL-1[15],部分高產納豆激酶酶活力為1137.15～1222.727U·mL-1[16-18]。此外，還有研究通過誘變得到的高產納豆激酶菌株，酶活可達1846.15～2095.23U·mL-1[19]。由表3可知，從4個產地獲得菌株中，N2、G1、S3、H3,酶活力分別為1926.41U·mL-1、1791.41U·mL-1、2079.65U·mL-1、1616.28U·mL-1，屬于高產酶活的菌株。

2.4 納豆芽孢桿菌的鑒定

將N2、G1、S3、H3以枯草芽孢桿菌為對照，各項具體指標結果見表4。

表4 納豆芽孢桿菌的鑒定

由表4可知，篩選得到的N2、G1、S3、H3的理化性質為革蘭氏反應、芽孢染色、葡萄糖實驗、木糖實驗、蔗糖實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗、淀粉水解實驗、明膠實驗、酪氨酸實驗、產過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗均與對照組枯草芽孢桿菌一致，由此可以判斷這4株菌均為枯草芽孢桿菌。

2.5 納豆激酶高產菌株的特性研究

2.5.1 對溫度的耐受性

菌株在制粒的過程中會遇到瞬時高溫,以及在運輸儲存的過程中會遇到高溫的影響，所以菌株對溫度的耐受性表現(xiàn)的越強,則菌種的活性越好,越不容易受到溫度的影響而死亡。

本實驗選用了92℃和96℃分別進行實驗。N2、G1、S3、H3存活率與溫度的關系見表5。

通過實驗可知，N2、G1、S3、H3的存活率受溫度的影響很大。條件為92℃和96℃水浴5min時，同一菌株的存活率相差較為明顯，相差達39%左右；隨著時間的增加，同一菌株的存活率差值逐漸降低，在10min時，同一菌株的存活率差值約為12%，不足15%。當時間在15min時，二者的存活率僅為4%左右。當時間在20min時，N2和S3還有0.11%、0.06%的存活率，剩下的G1和H3均被殺死。

因此,菌株N2和S3相對于G1和H3具有較強的溫度耐受性。

表5 納豆芽孢桿菌存活率與溫度的關系

2.5.2 對pH的耐受性

納豆芽孢桿菌作為菌劑在生產使用以及儲存的過程中,經常會遇到不同的pH,因此有必要考慮pH對菌種的影響以及其適應性。結果見表6。

表6 納豆芽孢桿菌存活率與pH的關系

由表6可知，N2、G1、S3、H3對不同pH值范圍表現(xiàn)出較強的適應性。pH范圍6.60～7.00的條件時，均達到85%以上，可見存活率都很高。pH為2.0～5.10的范圍內，4種菌株的存活率均受pH的影響較大。而在pH為2.20、3.30以及9.50時存活率損失很大，達到50%。因此菌株在偏酸以及偏堿的條件下不利于生長。通過比較，N2和S3具有較強的pH耐受性。

3 討論

本實驗采用稀釋涂布法從云南、貴州、陜西、湖南4個產地豆豉樣品中分離篩選出30株目標菌株，由產蛋白酶的特性，并測定納豆激酶活性，從4個地方各篩選出具有高產納豆激酶的菌株[20]：N2、G1、S3、H3，酶活力分別為1926.41U·mL-1、1791.41U·mL-1、2079.65U·mL-1、1616.28U·mL-1。

通過對高產納豆激酶菌株N2、G1、S3、H3進行了溫度、pH的耐受性研究，得出如下結論:N2和S3相較G1和H3而言，對溫度、pH的耐受性較強。在生產中若采用N2、S3菌種進行納豆的生產，在確保質量的前提下，可減少納豆的發(fā)酵時間，為企業(yè)以及廠家?guī)斫洕б妗2、S3菌種對環(huán)境(溫度和酸堿度)耐受更強，可在納豆生產環(huán)境受不可控因素影響時，保證產品的質量，保護企業(yè)、廠家的經濟效益。并且N2、S3菌種對菌株運輸、儲藏環(huán)境的要求相比其他菌株較低，同環(huán)境下更好地確保菌株存活率，節(jié)約了成本。該菌株對后續(xù)納豆激酶的研究，起到了一定的作用，有望作為納豆工藝生產的工業(yè)菌株，對于提高我國豆豉的質量、檔次以及在國際市場中的地位都具有良好的實用價值。