眼病外泌體生物學標志物的研究進展

梁高華　鐘敬祥

[專家介紹]鐘敬祥，教授，主任醫師，眼科學博士，博士生導師，博士后聯合培養導師。現為暨南大學附屬第一醫院副院長，暨南大學臨床醫學研究院常務副院長。長期從事干細胞治療、基因治療在眼科的臨床轉化應用研究、白內障及角膜相關研究。現任亞洲干眼協會中國分會委員、廣東省醫學會眼視光與近視防控學分會主任委員、廣東省醫師學會眼科分會副主任委員;廣東省中西醫眼科學會副主任委員;亞太區屈光手術協會委員;衛生部眼內鏡評審委員會委員;廣東省眼科學會委員;廣東省防盲學會常委;廣東省眼耳鼻喉創傷學會委員;廣東省醫師協會理事。在國內外期刊共發表學術論文100余篇（包括SCI）。先后承擔國家自然科學基金項目、國家重點基礎研究發展計劃項目、國家科技支撐計劃項目及廣東省自然科學基金項目等多項科研課題。先后榮獲2015年羊城好醫生、2016年廣東醫院優秀管理干部、2017年嶺南名醫、2017年暨南大學學位與研究生教育先進個人等稱號。《中華現代眼科雜志》常務編委、《眼科新進展》編委、《廣東醫學》特邀審稿委員。

【摘要】外泌體是細胞外囊泡的一個子集，直徑為40～160 nm（平均100 nm）的生物活性分子，包括蛋白質、遺傳物質（如mRNA、microRNA和DNA）、脂質、糖和細胞環境相關的結合物，存在于細胞外液如血液、腦脊液、唾液、淚液、眼房水等體液中，可介導細胞通訊、細胞分化、細胞廢物管理、免疫調節和新血管形成等多種生物功能。隨著外泌體研究的深入及個性化治療的迅猛發展，將外泌體研究擴展到眼部疾病迅速成為研究的焦點。

【關鍵詞】外泌體;眼病;生物學標志物

中圖分類號：R771文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.06.001

Research progress of the exosomes as biomarkers for eye diseases

LIANG Gaohua ZHONG Jingxiang

（1. Department of Ophthalmology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;

2. Department of Ophthalmology， First Affiliated Hospital of Jinan University， Guangzhou 510630， Guangdong， China）

【Abstract】? Exosome， as a subset of extracellular vesicles， is a kind of bioactive molecules with diameters of 40 to 160 nm （average 100 nm）， containing proteins， genetic materials （such as mRNA， microRNA and DNA）， lipids， sugar， and cell environment-related conjugates. It exists in extracellular fluids such as blood， cerebrospinal fluid， saliva， tears， and aqueous humor， etc.， and can mediate a variety of biological functions such as cell communication， cell differentiation， cell waste management， immunoregulation， and neovascularization， etc. With the deepening of exosome research and the rapid development of individualized treatment， the extension of exosome research to eye diseases has rapidly become the focus of research.

【Key words】exosomes; eye diseases; biomarkers

外泌體是細胞外囊泡的一個子集，直徑為40～160 nm（平均100 nm）的生物活性分子，包括蛋白質、遺傳物質[如mRNA、microRNA（miRNA）和DNA]、脂質、糖和細胞環境相關的結合物，存在于細胞外液如血液、腦脊液、唾液、淚液、眼房水等體液中，可介導細胞通訊、細胞分化、細胞廢物管理、免疫調節和新血管形成等多種生物功能。隨著外泌體研究的深入及個性化治療的迅猛發展，將外泌體研究擴展到眼部疾病迅速成了研究的焦點。本文主要對眼病的外泌體生物學標志物的研究進展，以及未來研究領域進行綜述。

1外泌體概述及其生物學特征

外泌體是在細胞外分泌，從細菌到人類的整個進化過程中都存在[1]，是具有雙層磷脂結構特征及與細胞具有相同的拓撲結構的膜結合體（雙膜囊泡）。到目前為止，共鑒定出與外泌體相關的9769個蛋白質、3408個mRNAs、2838個miRNAs和1116個脂質（http：//www.exocarta.org/），進行細胞交換、免疫調節、生物分子轉運和生理調節等胞內外信息交換作用[2～3]。外泌體中的生物分子成分因其來源細胞的類型和生理狀態不同而表現出不同生物功能，這使它們成為一種有吸引力的生物標志物，可以為我們提供一種動態方法來提高對疾病病理生物學的理解、預測疾病進展和免疫反應治療。

1.1信號轉導功能信號轉導是外泌體最基本、最重要的生物學功能。早期研究報告稱，外泌體可能是以細胞垃圾載體來排出細胞中的代謝廢物[4]。外泌體可以實現細胞間信號傳導，從而調節各種生理和病理過程，還可以將信息傳輸到多個單元和位置，而不需要自分泌、旁分泌和細胞間直接接觸的經典途徑。外泌體還可以通過內吞作用將其貨物轉移到受體細胞，從而改變細胞狀態并產生功能效應[5]。外泌體的攝取能力取決于受體細胞的類型而不是供體細胞的類型，這可能與器官特異性轉移密切相關[6]。因而，需要進一步研究來了解外泌體信號轉導的特定細胞和分子基礎。

1.2免疫調節功能外泌體在免疫學中的作用已被廣泛研究。B淋巴細胞衍生的外泌體通過主要組織相容性復合物（MHC）蛋白（MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ）執行抗原呈遞[7]。癌細胞和免疫細胞一樣，可以產生免疫活性外泌體，影響免疫調節機制。雖然外泌體免疫調節作用的研究主要集中在癌癥疾病上，但近年來也研究了外泌體在眼部疾病中的免疫調節潛力[8]。需要更進一步研究外泌體在免疫介導的眼病中的作用。

1.3修復再生功能外泌體包含著特定成分在各種疾病模型中修復和再生發揮重要作用。干細胞來源的外泌體能夠將特定成分（mRNA、miRNA和蛋白質）轉移到靶細胞或損傷部位來誘導血管生成和促進損傷后修復[9]。此外，來自間充質干細胞（MSCs）的外泌體通過促進遷移和增殖、增強基質合成、減少細胞凋亡和調節免疫反應來參與損傷的修復和再生[10]。同樣，外泌體促進再生的能力已在眼病模型中得到驗證。RPE細胞內經受氧化應激的外泌體顯示VEGFR-1和VEGFR-2的表達增加以及增強在內皮細胞中的血管生成能力[1]。數據表明，外泌體可能是MSCs的一個令人信服的替代品，將有助于避免使用鮮活MSCs-based治療所涉及的大多數問題[11]。

1.4作為生物學標志物外泌體具有作為多種疾病的生物標志物的潛力。研究發現，在健康個體和患有各種疾病的患者之間，外泌體的數量和外泌體中的特定生物活性物質存在顯著差異[12]。 外泌體也存在于與眼部密切相關的體液中，如房水（AH）[13]和玻璃體液（VH）[14]。外泌體的定向蛋白質組可以揭示RPE單層的極性特異性功能[15]。來自年齡相關性黃斑變性（AMD）、息肉狀脈絡膜血管病變（PCV）和視網膜中央靜脈阻塞（CRVO）相關研究顯示，所有這些患者AH中的特異性蛋白升高，提示AH中的外泌體蛋白可作為AMD診斷的生物標志物[16]。此外，AMD的主要病變部位RPE細胞的基底側可釋放外泌體也是診斷視網膜疾病的潛在生物標志物[17]。同樣，作為眼科疾病診斷的特異性標志物的外泌體及其RNA有效載體的潛力在最近引起了人們的廣泛關注。AH含有特征性的外泌體RNA，這可能為開發用于疾病診斷的外泌體提供重要的基礎信息[18]。

誠然，外泌體由于其結構組成、多樣化的生物學功能和獨特的生物學來源而帶來了廣泛的研究及應用領域，且外泌體在健康個體及疾患個體上均有不同表達，估計在信號轉換、免疫調節、修復、抗炎、藥物載體、氧化應激中顯示了其獨特的生物標志物作用，因此，越來越多的研究焦點集中在外泌體的治療作用，眼球是一個極其敏感的器官，隨著外泌體在眼病研究中的深入，外泌體在前后節眼病的作用機制是一個值得關注的問題。

2眼部疾病的外泌體生物學標志物

近年來，利用外泌體和其他EVs識別疾病生物標志物的興趣呈指數級增長，很容易理解為什么基于外泌體的診斷分析的開發潛力如此巨大。外泌體憑其獨有的特征，成為尋找新生物標志物的理想靶點：（1）脂質雙層保護外泌體內的RNA、DNA和蛋白質免受細胞外環境中的核酸酶和蛋白酶的影響;（2）外泌體包含組織、細胞或疾病特異性蛋白質和核酸;（3）外泌體的相對耐寒性可以使用多種方法從一系列體液（即血漿、血清、尿液、唾液、淚液、房水和腦脊液）中分離和富集。外泌體生物標志物在癌癥、心血管疾病和糖尿病研究領域的應用前景[19～21]促進了眼部疾病外泌體生物學標志物的研究。

2.1淚液從理論上講，淚液中眼病外泌體生物標志物的鑒定和表征具有很大的潛力。特別吸引人的是收集淚液的無創性質，但一個潛在的缺點是可以收集的體積相對較小。迄今為止，淚液作為外泌體生物標志物的來源尚未得到廣泛研究，我們在Pubmed搜索發現關于研究淚液中外泌體標志物的文獻甚少。淚液的蛋白質組學生物標志物研究已經確定了許多蛋白質（如膜聯蛋白和熱休克蛋白）與外泌體相關，盡管并未就此進行深入研究[22～23]，但隨著外泌體分離技術、蛋白質鑒定方法和核酸測序的最新進展，淚液源性外泌體生物標志物的診斷和治療潛力將是一個廣泛開放的研究領域。

2.2房水AH已被用于各種眼病的蛋白質、核酸和脂質生物標志物分析[24～26]。一些最常見的眼部疾病，例如青光眼[27～28]、AMD[29～30]、糖尿病相關眼病[31～32]和葡萄膜炎[33～34]等研究了AH中的生物標志物含量。盡管絕大多數核酸和脂質生物標志物，以及在AH中鑒定的一些蛋白質生物標志物很可能與外泌體相關，但很少有人關注外泌體特異性生物標志物。已有研究將EVs從AH中分離出來。例如，DISMUKE等首先證明外泌體是AH中主要的EVs類型，并含有特征性外泌體RNA，這可能為開發用于疾病診斷的外泌體提供重要的生物標志物[35]。外泌體的定向蛋白質組可顯示RPE單層的極性特異性功能[15]。有實驗室進行了幾項研究，重點關注AH中的外泌體及其在青光眼中的潛在作用，其中一項專門針對生成可用于識別外泌體生物標志物的數據[35]。最后，目前尚不清楚從RPE、Müller細胞、血管內皮細胞或其他視網膜細胞釋放的外泌體或其他小型EVs是否可以進入AH。為了幫助回答這個問題并可能識別新的AH外泌體生物標志物，需要對這些細胞類型在體外釋放的外泌體的組成進行基本表征。有正在進行的研究旨在仔細表征從RPE釋放的外泌體和其他EVs[15]，可用作識別和驗證AH中潛在外泌體生物標志物的資源。總之，未來關注AH眼病的外泌體生物標志物的研究必須利用適當的外泌體特異性方法進行分離;并且非常需要表征來自幾種不同視網膜細胞類型的外泌體的蛋白質和核酸組成。

2.3玻璃體液在玻璃體手術、常規抗VEGF和抗PDGF注射可以獲取VH，而不會讓患者感到更多不適。因此，如果可以識別和驗證強大的玻璃體外泌體生物標志物，那么它們的實際用途可能是巨大的。VH很有可能包含諸如AMD、萎縮型視網膜病變、糖尿病視網膜病變、青光眼和許多其他視網膜病變等疾病的特異生物標志物。在蛋白質組學、核酸和脂質組學方法的研究確定了視網膜靜脈阻塞[36]、AMD[37]、糖尿病視網膜病變[38]和原發性開角型青光眼[39]中發現有趣的潛在玻璃體生物標志物。然而，這些研究都沒有探索或討論外泌體在VH中生物標志物的運輸和存在中的作用。在這些研究中發現的一些生物標志物，例如AMD中的PED[40]和糖尿病視網膜病變中的角蛋白-1及PEDF[41]是與外泌體相關的蛋白質。外泌體特異性方法識別相關生物標志物的前景部分在于可以實現的特異性，而不是引用研究中使用的全局方法。對玻璃體中的蛋白質進行蛋白質組學鑒定，其中包含與外泌體相關的蛋白質和非外泌體相關蛋白質的混合物，有可能掩蓋任一部分疾病相關蛋白質的相關性。因此，通過專門分離EVs可以去除可溶性（非外泌體/EVs相關的）蛋白質，并避免潛在的混淆結果。在迄今為止的幾項研究中可以看到這種潛力顯示，將玻璃體內的EVs作為疾病生物標志物的來源[14，29，42]。

2.4血液血液成分，如血漿和血清，可能是在眼病中識別外泌體生物標志物的最有前途的體液。這在很大程度上是由于：（1）標本收集比AH和VH更容易且侵入性更小;（2）可以收集更大的體積。使用血液作為眼外泌體來源的一個缺點可能是，這些外泌體可能只占全身循環中外泌體總量的一小部分，因此難以檢測和分析。為了從血液中成功識別和分離眼部外泌體或小型EVs，對在健康和病理條件下從眼細胞釋放的外泌體進行基本描述性表征是必不可少的。一旦確定了眼部細胞特異性的外泌體相關標志物，它們就可用于將眼外泌體與血液中存在的大量非眼EVs中分離出來。如果沒有針對眼外泌體的富集步驟，開發基于血液的眼病生物標志物的任務可能是站不住腳的。目前，有基于免疫親和性的商業試劑盒可用于直接從人血漿和血清中分離外泌體（Diagenode、MBL International和System Biosciences），支持這種方法的可行性。然而，在許多情況下，如果樣本來自人類以外的其他物種（因為大多數商業試劑盒僅針對人類樣本開發），或者如果不是商業提供的目標，則在許多情況下仍然需要開發和驗證內部免疫親和方法套件的重要性。最近，一種被稱為“液體活檢”的新的診斷概念出現了，預示著腫瘤微創基因特征的巨大潛力。目前研究支持血液循環腫瘤細胞（CTCs）、循環腫瘤DNA（ctDNA）、miRNA和外泌體作為葡萄膜黑色素瘤（UM）的生物標志物的可能性證據[43～44]。特別是這些生物標志物有在UM患者管理過程中幫助臨床決策的潛力。該研究代表了一個令人鼓舞的概念驗證，用于識別體循環中眼病特異性生物學標志物。

3小結與展望

雖然我們對外泌體在癌癥中及其他領域中的作用已經了解很多，但外泌體在許多眼部特殊組織中的功能才剛剛開始進行嚴格的研究。多項研究為外泌體在眼病的病理過程中發揮重要作用提供了證據，包括炎癥、神經元變性、氧化應激和新生血管形成。此外，外泌體具有跨越生物屏障的能力，可作為生物標志物或治療載體，可能為眼病患者帶來新的希望。然而，基于外泌體的復雜性和多樣性，外泌體在眼科疾病中的功能和機制還需要進一步研究，尤其是其作為生物標志物或治療載體方面的研究。因此，在眼科疾病中發展眼部體液源性外泌體生物標志物及治療方案需要大量的研究，擁有廣闊的研究及應用前景。參考文獻[1] LI S F，HAN Y，WANG F，et al.Progress in exosomes and their potential use in ocular diseases[J].Int J Ophthalmol，2020，13（9）：1493-1498.

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