鹿紅方調節PI3K/AKT通路抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡機制研究

趙丹丹，瞿惠燕，楊濤，張曉青，郭佳瑩，周華

上海中醫藥大學附屬曙光醫院心病研究所，上海 201203

心力衰竭是大多數心血管疾病的終末階段，具有較高的發病率和病死率，且預后較差。左心功能與結構改變是心力衰竭發生發展的預測指標，與心肌細胞的進行性丟失密切相關。細胞凋亡是心肌細胞進行性丟失的主要原因。有研究表明，細胞凋亡參與心臟由代償性肥大到失代償性重構的全過程。因此，抑制或消除凋亡級聯反應可能有利于阻止不良重構和心力衰竭的進展。PI3K/AKT通路是機體具有多重效應的信號通路，并可通過調節Bcl-2家族成員活性與表達調控細胞凋亡，參與心力衰竭的病理生理過程。

研究表明，中醫藥辨證論治心力衰竭具有多靶點、多途徑調節的作用。鹿紅方是周華教授治療心力衰竭的有效經驗方，具有補腎強心、活血通絡功效，已在臨床應用數十年。課題組前期研究發現，鹿紅方可以改善心力衰竭患者心功能與臨床癥狀，抑制心力衰竭動物模型心肌細胞焦亡與炎癥反應，延緩心力衰竭進程。基于此，本研究通過結扎冠狀動脈制備心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，觀察鹿紅方能否通過調控PI3K/AKT通路抑制心肌細胞凋亡，為鹿紅方的臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，7～8周齡，購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（浙）2019-0001。大鼠飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，溫度（22±2）℃、相對濕度55%～75%環境，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實驗經上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（PZSHUTCM190322020）。

1.2 藥物及制備

鹿紅方（鹿角片15 g，紅花9 g，山萸肉15 g，補骨脂20 g，淫羊藿30 g，女貞子30 g，沉香6 g），飲片購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院。按比例稱取飲片，加10倍量水浸泡45 min，煎煮85 min，過濾，收集濾液，藥渣再加水煎煮45 min，過濾，合并2次濾液，減壓濃縮，噴霧干燥，制成干浸膏備用（每克浸膏含原藥材4.08 g），使用前加蒸餾水配制成濃度為0.276 g/mL。培哚普利片，8 mg/片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號190527-02，使用前加適量蒸餾水配制成濃度為0.072 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL試劑盒（武漢賽維爾，貨號G1501），B型利鈉肽（BNP）試劑盒（上海朗頓生物，貨號BPE30445），異氟烷（上海玉研，貨號S10010533），BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、SDS-PAGE配制試劑盒、BSA（上海碧云天生物，貨號分別為P0012、P1045、P0013C、P0012AC、ST023-200g），PI3K 抗體（美國CST，貨號4249），Akt抗體（美國CST，貨號4691），p-Akt抗體（美國CST，貨號4060），Bcl-2 抗體（英國Abcam，貨號ab196495），GAPDH 抗體（美國CST，貨號5174），Bax 抗體（美國Proteintech，貨號50599-2-Ig），HRP標記山羊抗兔IgG抗體（美國CST，貨號7074）。小動物超聲影像系統（美國GE，型號VIVID5），小動物麻醉機、呼吸機（上海玉研，型號分別為ABS-100、SAR-100），動物用心電圖機（深圳邦健，型號ECG-101G），多功能酶標儀（美國BioTek，型號Synergy H1），化學發光成像系統（上海天能，型號4600SF）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

60只大鼠隨機分為假手術組、模型組、鹿紅方組和培哚普利組，每組15只。除假手術組外，其余大鼠參照文獻[9]方法通過結扎左冠狀動脈前降支（LAD）制備心力衰竭模型。大鼠術前禁食12 h，異氟烷吸入麻醉，連接呼吸機，于左胸第3、4肋間靠近胸骨處剪開皮膚，打開胸腔，去除心包膜，在左心耳下緣2 mm處用6-0號帶針絲線結扎LAD，結扎成功可見心尖部變白、心電圖Ⅱ導聯ST段明顯抬高。將心臟復位，關閉胸腔，逐層進行縫合。術后連續7 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）預防感染。假手術組僅穿線不結扎，其余操作步驟同前。

術后第2日開始灌胃，按照人與動物體表面積法換算給藥劑量，鹿紅方組給藥劑量為2.76 g/（kg·d），培哚普利組給藥劑量為0.72 mg/（kg·d），灌胃體積1 mL/100 g，假手術組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續8周。

2.2 超聲檢測

末次給藥結束后，大鼠異氟烷吸入麻醉，采集M型超聲圖像，檢測大鼠心臟左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室舒張末期內徑（LVIDd）和左室收縮末期內徑（LVIDs），評價大鼠心功能和結構。

2.3 ELISA檢測

BNP由心室肌細胞分泌，是目前心力衰竭診斷、評估病情與預后的常用指標，與疾病的嚴重程度呈正相關。超聲檢測結束后，行腹主動脈穿刺采血，常溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離上清液，按試劑盒說明書檢測大鼠血清BNP含量。

2.4 HE和Masson染色

腹主動脈取血結束后，迅速摘取大鼠心臟，用預冷生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。常規脫水，石蠟包埋，切片，分別進行HE 染色和Masson染色，觀察心肌組織病理改變和纖維化情況。采用Image J軟件計算心肌纖維化面積，心肌纖維化面積（%）＝膠原面積÷視野總面積×100%。

2.5 TUNEL檢測

取大鼠心肌組織石蠟切片，脫蠟至水，蛋白酶K進行抗原修復，破膜，加TUNEL顯色反應液，37 ℃孵育2 h，DAPI復染細胞核，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，每張切片選取3個不重疊視野，采用Image J軟件計算心肌細胞凋亡指數。心肌細胞凋亡指數（%）＝凋亡細胞數÷總細胞數×100%。

2.6 Western blot檢測

取50 mg心肌組織，加入裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜，5%BSA 室溫封閉2 h，TBST 洗膜7 min×3 次，滴加PI3K 一抗（1∶1 000）、AKT 一抗（1∶1 000）、p-AKT一抗（1∶2 000）、Bcl-2一抗（1∶1 000）、Bax一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶2 000），4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜7 min×3 次，滴加相應二抗（1∶3 000），常溫孵育2 h。TBST 洗膜7 min×3 次，滴加ECL 發光液，化學發光成像系統獲取圖像，以GAPDH為內參，Image J軟件計算各條帶灰度值。

3 統計學方法

4 結果

4.1 鹿紅方對模型大鼠心功能的影響

與假手術組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS明顯降低（＜0.01），LVIDd、LVIDs 明顯升高（＜0.01），提示長期容量負荷超載導致大鼠左心功能降低，心臟結構發生改變，心力衰竭模型復制成功。與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠LVEF、LVFS明顯升高（＜0.01），LVIDd、LVIDs 明顯降低（＜0.01）；與鹿紅方組比較，培哚普利組大鼠LVEF、LVFS明顯升高（＜0.05），LVIDd、LVIDs差異無統計學意義（＞0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較（）

4.2 鹿紅方對模型大鼠血清B型利鈉肽含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清BNP含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠血清BNP含量明顯減少（＜0.01）；鹿紅方組與培哚普利組差異無統計學意義（＞0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清BNP含量比較（，ng/L）

4.3 鹿紅方對模型大鼠心肌組織病理變化的影響

HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞排序有序，形態、結構正常，細胞核致密清晰；模型組大鼠心肌組織有不同程度變性、壞死，心肌細胞排列紊亂、結構模糊，局部心肌細胞消失，被增生的結締組織取代，有大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織病理損傷均明顯改善，心肌細胞水腫、壞死明顯減輕，排列略不規則，有少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態（HE染色，bar=200 μm）

4.4 鹿紅方對模型大鼠心肌纖維化的影響

Masson染色中正常大鼠心肌組織呈紅色，膠原纖維呈藍色。結果顯示，假手術組大鼠心肌組織僅在血管周圍有少量散在的膠原纖維沉積；與假手術組比較，模型組大鼠膠原纖維沉積嚴重，心肌纖維化面積明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織膠原纖維沉積明顯減輕，心肌纖維化面積明顯減少（＜0.05）；鹿紅方組與培哚普利組比較差異無統計學意義（＞0.05）。結果見圖2、表3。

表3 各組大鼠心肌纖維化面積比較（，%）

圖2 各組大鼠心肌組織形態（Masson染色，bar=3 mm）

4.5 鹿紅方對模型大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色中陽性凋亡細胞核呈綠色熒光。結果顯示，假手術組大鼠僅有少量心肌細胞凋亡；與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡增加，心肌細胞凋亡指數明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌細胞凋亡指數明顯降低（＜0.01）；鹿紅方組與培哚普利組比較差異無統計學意義（＞0.05）。結果見圖3、表4。

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，bar=20 μm）

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較（，%）

4.6 鹿紅方對模型大鼠心肌組織PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bax蛋白表達明顯升高（＜0.01，＜0.05），Bcl-2 蛋白表達明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bax 蛋白表達明顯降低（＜0.01，＜0.05），Bcl-2蛋白表達明顯升高（＜0.01）；鹿紅方組與培哚普利組差異無統計學意義（＞0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（）

5 討論

心力衰竭發病機制復雜，涉及病理因素眾多。目前認為，心室重構是心力衰竭發生發展的基本機制，心肌細胞凋亡是心室重構的重要病理基礎。正常情況下，細胞凋亡一般在衰老的細胞中發生，是機體維持細胞動態平衡的自我保護機制。當受到缺血、缺氧等損傷刺激時，機體氧化應激水平增加、炎癥因子增多、細胞膜完整性及穩定性被破壞，導致細胞凋亡發生。心肌細胞過度凋亡可使心肌細胞數量驟減，心臟收縮與舒張功能失常，最終導致心腔擴大、心室壁變薄、心肌肥大等心肌重構的病理表現。因此，有效抑制心肌細胞凋亡對心力衰竭的防治和預后具有積極意義。

PI3K/AKT信號通路具有多種效應功能，在調節血管再生、內皮細胞功能、心肌細胞凋亡及糖脂代謝中具有重要作用，其對凋亡的調控主要體現在直接或間接調節Bcl-2/Bax蛋白表達。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中起重要作用，Bcl-2、Bax蛋白表達水平與凋亡調控直接相關。PI3K是由催化亞基（p110）和調節亞基（p85）兩部分構成的二聚體蛋白，當接收到刺激信號時，機體可通過2條途徑將底物二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉變為三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）而活化，活化后的PIP3進一步與AKT結合，使AKT募集到膜上而磷酸化激活。AKT磷酸化（p-AKT）水平是PI3K/AKT信號通路活化的重要標志之一。研究表明，長期心力衰竭患者心肌組織p-AKT水平顯著升高，經左室輔助裝置治療后心肌組織p-AKT水平下降，心肌肥厚減輕，心功能得到改善。研究發現，心力衰竭模型小鼠p-AKT水平明顯升高，可誘導Bax表達，促進心肌細胞凋亡，而抑制p-AKT表達可有效改善模型小鼠心功能，減少心肌細胞凋亡，減輕心肌肥厚。

中醫學認為，心力衰竭為本虛標實之證，本虛以心氣虛、心陽虛為主，標實以水飲、瘀血、痰濁為患。由于“心腎相交”“水火既濟”，心陽虛不能下歸于腎，導致腎陽漸虛，腎陽虛衰又無以溫煦心陽，終致心腎陽虛。腎陽為一身陽氣之本，“五臟之陽氣非此不能發”。因此，心力衰竭中醫治療強調“心腎同治”，鹿紅方正是在此理論基礎上創制而成。方中鹿角片溫陽補腎、行血消腫，紅花活血袪瘀通經，二者共為君藥；補骨脂、淫羊藿助君藥溫腎助陽之力，二者皆為臣藥；山萸肉、女貞子補益肝腎之陰陽，沉香溫腎納氣平喘，三藥合用調補陰陽，共為佐使藥。諸藥合用，共奏溫腎強心、活血通絡功效。

本實驗以LAD結扎法制備心力衰竭大鼠模型，以鹿紅方干預，發現鹿紅方可有效提高模型大鼠心功能，降低血清BNP含量，減輕心肌纖維化，抑制心肌細胞凋亡，并且下調PI3K、p-AKT、Bax蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達，提示其抗凋亡機制與抑制PI3K/AKT/Bax信號通路活化有一定關系。本研究揭示了鹿紅方抑制心肌細胞凋亡的可能作用機制，為其臨床應用和深入研究提供一定實驗依據。