阿司匹林和氯吡格雷聯合應用對小鼠腦缺血損傷后骨髓及腦內炎癥反應的影響

董雯，姜鳴鈺，陳文濤，劉文倩，陳青芳，趙順英，葉維貞，溫少紅，劉向榮

臨床研究證明，阿司匹林和氯吡格雷聯合應用能有效降低輕型缺血性卒中和TIA患者的卒中復發率[1-2]。進一步分析發現，阿司匹林和氯吡格雷聯合應用的最佳持續時間為卒中發生后的21 d[3]，但目前阿司匹林和氯吡格雷聯合作用的機制尚不明確。

中性粒細胞是人體固有免疫系統中重要的效應細胞，主要產生于骨髓[4]。腦缺血后，中性粒細胞通過分泌炎癥因子，釋放自由基，形成中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）增加血栓形成等機制介導腦缺血損傷[5]。小膠質細胞是中樞神經系統中主要的免疫效應細胞[6]，激活的小膠質細胞根據功能主要分為促炎（M1）和抗炎（M2）兩種極化表型[7]。腦缺血后，小膠質細胞介導腦缺血損傷還是神經保護作用取決于其在促炎和抗炎表型中的動態平衡[8]。本研究利用小鼠大腦中動脈遠端缺血再灌注模型分析阿司匹林和氯吡格雷聯合應用對腦缺血后骨髓中性粒細胞分泌的炎癥因子、小膠質細胞3D形態以及極化狀態的影響，以探索雙聯抗血小板治療可能的作用機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物 選取雄性C57BL/6小鼠20只（8～10周齡，體質量25±0.5 g，北京華阜康生物科技控股有限公司），飼養于12 h循環照明，溫度22～24 ℃環境中，自由攝食水。本實驗遵照動物倫理（批號：202002003）相關要求進行。

1.2 模型制作與分組 模型制作：小鼠異氟烷麻醉后取右側臥位，在右耳和右眼之間正中開口，找到并結扎大腦中動脈遠端。1 h后解開結扎線實現再灌注。術中通過監測腦血流判斷模型成功。術中小鼠肛溫保持在37±0.5 ℃。

模型成功后小鼠隨機分為對照組和雙抗組，每組各10只。對照組在再灌注即刻通過灌胃給予飲用水100 μL；雙抗組在再灌注即刻通過灌胃給予阿司匹林（劑量12 mg/kg，每只實際用量0.3 mg）與氯吡格雷（劑量12 mg/kg，每只實際用量0.3 mg）混懸液100 μL，每日1次，連續21 d。

1.3 骨髓中性粒細胞分離 應用骨髓中性粒細胞分離試劑盒（索萊寶，中國）。造模后21 d處死小鼠，分離股骨和脛骨，用含10%胎牛血清的培養基沖洗髓腔以獲得骨髓，制備骨髓單細胞懸液，室溫離心，吸取中性粒細胞層。應用清洗液重懸細胞，離心后備用。

1.4 炎癥因子測定 應用RNA提取試劑盒（Qiagen，德國）提取骨髓中性粒細胞RNA，應用逆轉錄試劑盒（Invitrogen，美國）將信使RNA（messenger RNA，mRNA）逆轉錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），之后進行實時熒光定量PCR擴增。應用2-△△Ct計算對照組與雙抗組之間擴增指標的相對表達量。擴增指標包括IL-1β、IL-6、IL-10、幾丁質酶樣蛋白（chitinase-like 3，Chil3/YM1）、誘導型一氧化氮合酶（i nducible nitric-oxide synthase，iNOS）、TNFα、精氨酸酶1（arginase1，Arg1）、轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）、CD206、CD32。引物序列見表1[9]。

1.5 組織免疫熒光染色 小鼠腦組織固定后包埋，行冰凍切片。應用Triton X100透化切片，室溫封閉1 h，之后進行離子化鈣結合適配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）（和光純藥，日本）和CD16（BD bioscience，美國）或Iba1和CD206（R&D Systems，美國）共染過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液洗后，應用抗兔（Jackson，711-545-152）、抗大鼠（Jackson，712-165-150）和抗羊（Jackson，705-165-003）熒光二抗分別進行標記。CD16+Iba1+標記梗死周邊區M1型小膠質細胞；CD206+Iba1+標記梗死周邊區M2型小膠質細胞。使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，德國）拍攝圖像。應用軟件Imaris 9.0.1對小膠質細胞3D圖像進行分析，包括細胞突起長度、突起數量、突起分叉點數量和終末點數量。應用Image J軟件統計CD16和Iba1雙陽以及CD206和Iba1雙陽細胞數。

1.6 統計方法 使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統計，計量資料符合正態分布，用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨髓中性粒細胞相關炎癥因子表達情況與對照組相比，雙抗組促炎因子I L-1β的mRNA水平下降，抗炎因子YM1和CD206的mRNA水平上升，差異有統計學意義，2組其他炎癥因子的表達差異無統計學意義（表2）。

表2 腦缺血再灌注后21 d骨髓中性粒細胞炎癥因子相對表達量

2.2 腦缺血再灌注后小膠質細胞形態學變化對單個小膠細胞形態的3D分析顯示，與對照組相比，雙抗組腦梗死周邊區小膠質細胞突起長度（109.40±23.42 μmvs. 92.48±28.25 μm，P=0.014）、突起數量（58.63±39.55個vs. 13.27±10.54個，P<0.001）、突起分叉點數量（25.43±17.54個vs. 5.70±5.03個，P<0.001）、突起終末點數量（30.00±19.97個vs. 7.63±5.55個，P<0.001）均增加（圖1）。2.3 腦缺血再灌注后小膠質細胞極化狀態 腦缺血再灌注21 d后雙抗組與對照組梗死周邊區小膠質細胞數量無統計學差異，單位面積（1 mm2）中分別有395.5±85.59個和413.3±97.84個（P=0.588）。但2組的小膠質細胞極化情況差異有統計學意義，雙抗組和對照組梗死周邊區域單位面積（1 mm2）中CD16陽性的小膠質細胞分別有119.4±37.43個和220.2±63.07個，雙抗組較低（P<0.001）；C D 2 0 6 陽性的小膠質細胞數量分別為198.2±40.16個和122.8±29.88個，雙抗組較高（P<0.001）（圖2）。

圖1 腦缺血再灌注后21 d腦組織梗死周邊區小膠質細胞形態

圖2 腦缺血再灌注后21 d不同組別腦組織小膠質細胞極化狀態

3 討論

本研究應用小鼠輕型急性腦缺血再灌注模型，連續21 d給予阿司匹林和氯吡格雷灌胃，發現聯合用藥顯著降低骨髓中性粒細胞促炎因子IL-1β的表達，同時提高抗炎因子YM1和CD206的表達。聯合用藥增加腦梗死周邊區小膠質細胞分支，同時促進小膠質細胞由M1型向M2型轉化。以上結果提示，阿司匹林和氯吡格雷聯合應用可能通過降低骨髓和腦內的炎癥反應，從而保護腦缺血損傷。

炎癥是腦缺血后主要的病理過程，同時也是影響卒中預后的重要因素[10]。中性粒細胞被認為是固有免疫系統的第一道防線。臨床研究和動物實驗均表明，中性粒細胞的功能異質性取決于疾病和炎癥階段[11]。促炎型即N1型中性粒細胞通過產生IL-1β、TNFα、NO和過氧化氫等細胞因子或效應因子，加重炎癥損傷。相反，N2型中性粒細胞表達YM1、CD206和Arg1[12]，并產生抗炎因子IL-10、TGFβ和VEGF等，有助于組織重建和損傷修復，從而起到神經保護作用[13]。本研究中，雙抗組促炎因子水平降低，抗炎因子水平升高，提示阿司匹林和氯吡格雷聯合用藥可能通過提高中性粒細胞的抗炎作用促進腦缺血損傷的恢復。

靜息狀態下，小膠質細胞通過突觸擺動執行免疫監視功能，維持腦組織內微環境的動態平衡[14]。疾病狀態下，小膠質細胞形態發生改變，表現為突起數量、分叉點數量和終末點數量增多，以便提高小膠質細胞的免疫監測范圍[15]。小膠質細胞激活后分為促炎（M1型）或抗炎（M2型）兩種表型。M1極化表型通過釋放促炎因子加速腦缺血損傷進程；M2型具有抗炎功能，可保護神經細胞存活[8]。因此，小膠質細胞從M1型向M2型轉化被認為是治療腦缺血損傷的潛在方向之一。本研究發現，阿司匹林和氯吡格雷聯合應用之后，腦梗死周邊區小膠質細胞呈現出多突起多分支狀，擴大了其免疫監測范圍；另外，小膠質細胞向M2抗炎表型轉化，提示雙抗聯合用藥可抑制梗死周邊的炎癥反應。

小膠質細胞異常激活可通過加重腦白質損傷導致認知功能下降[16]。本課題組前期研究結果顯示，阿司匹林與氯吡格雷聯合應用能顯著改善腦缺血小鼠的認知功能[17]。結合本課題組一系列研究結果，提示阿司匹林和氯吡格雷聯合應用可通過減少骨髓中性粒細胞和腦內小膠質細胞的炎癥反應從而起到神經保護作用。然而，聯合用藥如何影響骨髓中性粒細胞抗炎和促炎因子的釋放以及小膠質細胞的極化還需進一步的探索。

【點睛】本研究在小動物缺血再灌注模型中驗證了阿司匹林和氯吡格雷聯合應用21 d可提高骨髓中性粒細胞的抗炎作用以及調節腦內小膠質細胞的激活與極化，提示雙聯抗血小板治療可能通過上述機制起到抑制腦缺血損傷的作用。