鎘脅迫對延胡索生理及生物堿積累的影響

展曉日，吳琦聰，黃潔芳，沈晨佳，王慧中

(杭州師范大學生命與環境科學學院 浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310036)

延胡索(Corydalisyanhusuo)別稱元胡、玄胡索、玄胡，為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，廣泛分布于我國江南丘陵地帶。延胡索是傳統道地藥材“浙八味”之一，以地下塊莖入藥，具有活血、化瘀、止痛等作用[1]。浙江東北部平原丘陵地帶包括嘉興、紹興和金華地區是延胡索的主產區，延胡索也是當地藥農的收入的重要來源[2-3]。現代藥學研究表明，延胡索制劑對于治療冠心病、胃腸潰瘍及多種腫瘤疾病具有良好藥效。而延胡索中的主要活性成分為多種特有的生物堿，如原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素等[4]。因此，生物堿含量是延胡索質量的重要指標。

隨著經濟的快速發展，大量工業廢水進入農田水域，造成土壤重金屬嚴重超標。重金屬鎘(Cd)被作物吸收富集，通過食物鏈進入人體，可引起慢性中毒[5]。由此可見，重金屬Cd超標對生態環境及人體健康造成很大影響[6]。針對延胡索重金屬脅迫的研究已有部分報道。余順慧等[7]研究表明，鉻污染對延胡索生長和生理特性有顯著影響。李云躍等[8]發現，重金屬鉛對延胡索生長及不同器官生物量的積累有顯著的抑制作用。但重金屬Cd脅迫對延胡索的生長及生物堿產量的影響還尚且未知。本研究以延胡索為研究對象，設置不同濃度Cd處理，測定延胡索在Cd脅迫下的生理指標和生物堿積累情況。本研究的結果對理解延胡索對重金屬Cd脅迫的響應機制，優化延胡索的栽培條件提供了實踐經驗和理論指導，具有較高的應用價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗植物材料延胡索(Corydalisyanhusuo)栽培于杭州師范大學倉前校區種植基地。

1.2 處理設計

試驗材料為延胡索塊莖，篩選大小一致的塊莖100塊左右，種植于獨立花盆(直徑30 cm)中，每盆裝土壤10 kg，進行常規土肥管理。

本試驗采用1個對照組和3個處理組，每組3個平行重復。開展Cd單一環境因子脅迫試驗，處理組以CdCl2作為Cd2+來源。將栽培的延胡索幼苗取出后進行水培，營養液中的Cd2+濃度分別為0，100，200，300 μmol·L-1。鎘脅迫處理6 d后，收集延胡索幼苗葉片至1.5 mL離心管，用液氮冷凍后，移至-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 延胡索葉綠素、可溶性蛋白等含量測定

葉綠素含量采用紫外分光光度法測定。每組試驗操作都進行3個生物學重復。鮮葉片剪成細絲狀后準確稱取0.2 g，放入加有25 mL丙酮-乙醇混合提取液(體積比為1∶1)的試管中，封口后將試管置于暗處直至葉片顏色完全變白。使用DU-800紫外/可見光分光光度計分別在663、646和470 nm下測定浸提液的吸光值。

可溶性糖含量測定采用蒽酮法[9]。將樣品從-80 ℃冰箱中取出，稱取250 mg，加入10 mL去離子水，煮沸30 min，定容于25 mL。顯色反應吸取0.5 mL樣本溶液，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸，充分振蕩后置于沸水浴中煮沸，冷卻后，在630 nm波長下測定其吸光度。

脯氨酸含量使用酸性茚三酮法測定。稱取不同試驗組的延胡索葉片各500 mg，加入3%磺基水楊酸5 mL，沸水浴10 min后，加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮試劑，沸水浴30 min，冷卻后加入4 mL甲苯終止反應，在520 nm波長處測定吸光值。

1.4 延胡索丙二醛(MDA)含量測定

MDA采用硫代巴比妥酸法測定[10]。稱取延胡索葉片樣本1 g，加入10 mL的10% TCA緩沖液，研磨成勻漿，離心后得上清液。吸取2 mL上清液，以去離子水為空白對照，加入2 mL 0.6%的TBA緩沖液，沸水浴15 min，冷卻后離心取上清液，測定532 nm、600 nm和450 nm波長下的吸光度。

1.5 延胡索3種酶活性測定

使用武漢賽培生物科技有限公司試劑盒測定過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和過氧化物酶(CAT、SOD和POD)活性，試驗方法參見產品說明書。

1.6 延胡索不同生物堿含量測定

分別精確稱量原阿片堿(5.24 mg)、小蘗堿(5.16 mg)、延胡索乙素(4.60 mg)和脫氫紫堇堿(5.06 mg)標準品，定容于10 mL容量瓶中，得到對照品母液，依次逐級稀釋。將延胡索塊莖取樣，粉碎之后精確稱取0.5 g，加入氨水-甲醇(1∶20)混合液50 mL，冷浸1 h，熱回流1 h，冷卻后吸取濾液25 mL，蒸干后，用甲醇溶解所得固體物，定容后備用。

色譜柱為Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，三乙胺pH調為6.0；梯度洗脫程序為0∶100(0 min)→20∶80(15 min)→80∶20(35 min)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm。

1.7 數據統計學分析

采用Excel軟件進行試驗數據處理，使用SPSS 22.0分析軟件進行方差分析，P<0.05表示樣本間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 重金屬鎘脅迫對延胡索總葉綠素含量的影響

葉綠素是植物生長發育的必需色素，是光合作用得以順利進行的基礎條件，直接關系到光合作用的水平。使用0、100、200、300 μmol·L-1的鎘溶液，處理延胡索幼苗6 d，測定總葉綠素含量的變化。結果表明，對照組的延胡索總葉綠素含量為1.54 mg·g-1，6 d之后葉綠素含量基本保持不變；處理組葉綠素含量有著顯著下降，在100 μmol·L-1鎘脅迫下葉綠素含量下降為1.30 mg·g-1，在200 μmol·L-1鎘脅迫下葉綠素含量下降為1.11 mg·g-1，在300 μmol·L-1鎘脅迫下葉綠素含量下降為1.23 mg·g-1(圖1)。

*表示處理與對照間差異顯著(P<0.05)，圖2～4同。

2.2 重金屬鎘脅迫對延胡索脯氨酸含量的影響

近年來的研究表明，重金屬脅迫會導致植物體內脯氨酸的大量積累，以提高植株對重金屬脅迫的抗性和適應性。使用0、100、200、300 μmol·L-1的鎘溶液，處理延胡索幼苗6 d，測定脯氨酸含量的變化。結果表明，對照組的延胡索脯氨酸含量為235.5 μg·g-1，6 d之后脯氨酸含量基本保持不變；處理組脯氨酸含量有著顯著上升，在100 μmol·L-1鎘脅迫下脯氨酸含量上升為446.1 μg·g-1，在200 μmol·L-1鎘脅迫下脯氨酸含量上升為475.1 μg·g-1，在300 μmol·L-1鎘脅迫下脯氨酸含量上升為390.5 μg·g-1(圖1)。

2.3 重金屬鎘脅迫對延胡索可溶性蛋白含量的影響

重金屬進入植物體后會抑制各類代謝活動，尤其是蛋白質的合成，而可溶性蛋白質含量是重金屬脅迫的重要測定指標。圖1表明，對照組的延胡索可溶性蛋白含量為1.47 mg·g-1，6 d之后可溶性蛋白含量基本保持不變；處理組可溶性蛋白含量有著顯著上升，在100 μmol·L-1鎘脅迫下可溶性蛋白含量上升為3.48 mg·g-1，在200 μmol·L-1鎘脅迫下可溶性蛋白含量上升為3.11 mg·g-1，在300 mmol·L-1鎘脅迫下可溶性蛋白含量上升為2.14 mg·g-1。

2.4 重金屬鎘脅迫對延胡索MDA含量的影響

MDA是重金屬脅迫下，植物生物膜系統受損的重要指標，它反映膜脂過氧化的程度。如圖2所示，在對照組中MDA保持較低水平，鎘處理顯著誘導MDA含量水平(0.093 μmol·g-1)。在鎘處理6 d后，MDA含量顯著上升，其中在300 μmol·L-1鎘脅迫下上升接近十倍(0.951 μmol·g-1)。而鎘處理濃度越高，MDA含量積累也更高，表明在高濃度鎘脅迫下，植物膜脂系統遭到更為嚴重的破壞。

圖2 重金屬鎘脅迫對延胡索MDA含量的影響

2.5 重金屬鎘脅迫對延胡索的抗氧化酶活性的影響

CAT、SOD和POD是植物體內的抗氧化酶系統的重要組成部分，它們三者相互協調配合可以有效地清除植物體內的氧自由基和過氧化物。CAT具有極強的催化能力，將H2O2分解為O2和H2O。鎘脅迫導致CAT活性下降，從對照組的211.2 U·g-1，下降大約50%。其中，高濃度鎘處理(300 μmol·L-1)導致CAT活性下降最多，從211.2 U·g-1下降到109.2 U·g-1(圖3)。SOD是一類超氧化物歧化酶，負責清除植物體內的氧自由基。鎘脅迫導致SOD活性顯著下降，隨著鎘處理濃度的升高，SOD活性下降更為明顯。在300 μmol·L-1鎘處理下，SOD活性從155.0 U·g-1下降為86.4 U·g-1。POD和SOD發揮著同等作用，也是超氧化物歧化酶的一種。鎘脅迫導致POD活性顯著上升，在對照組下POD的活性僅為535.7 U·g-1，在100 μmol·L-1鎘處理下POD活性上升最為顯著，達到2 954.8 U·g-1。隨著鎘處理濃度上升，POD活性上升幅度反而有所下降，在300 μmol·L-1鎘處理下POD活性為1 140.9 U·g-1。

圖3 重金屬鎘脅迫對延胡索3種抗氧化酶活性的影響

2.6 重金屬鎘脅迫對延胡索生物堿含量的影響

延胡索含有一系列生物堿，是其主要的活性成分，重金屬污染是否影響延胡索生物堿的含量是被關注的重要問題。本研究中，選擇4種延胡索標志性的生物堿類活性成分，探索鎘脅迫處理對延胡索生物堿含量的影響。在鎘脅迫處理下，4種生物堿活性物質含量均有所下降，其中小蘗堿的下降幅度最為明顯。原阿片堿含量在鎘脅迫處理下顯著下降，但是不同濃度的鎘處理對其含量影響不大(圖4)。小蘗堿含量在不同濃度鎘脅迫處理下并不相同，鎘濃度越高，其含量下降越顯著。延胡索乙素和脫氫紫堇堿在低濃度鎘脅迫下(100和200 μmol·L-1)下降幅度較小，在高濃度鎘脅迫處理下，下降幅度達到50%。

圖4 重金屬鎘脅迫對延胡索4種生物堿含量的影響

3 小結與討論

延胡索是我國重要的中藥材之一，也是其主產地藥農增收的主要經濟作物[11]。延胡索活性成分主要由各類生物堿組成，生物堿的含量是延胡索經濟價值的重要指標。然而，延胡索活性成分含量會受到外界環境的影響，進而影響到延胡索的藥效。有研究表明，影響延胡索活性成分含量的因素主要與延胡索品種、提取加工工藝、產地和環境因素等有關[12-13]。隨著環境污染的加劇，環境因素越來越成為影響延胡索品質的決定性因素。

重金屬鎘是影響植物類中藥材的環境風險因子之一，危害人體健康。生理數據表明，鎘脅迫顯著降低延胡索中的葉綠素含量，說明其可能通過降低延胡索光合生理特性而影響幼苗的生長發育，這與其他多種植物在鎘脅迫下的表現一致，如水稻、夏枯草等[14-15]。此外，低濃度鎘脅迫顯著提高脯氨酸和可溶性蛋白的含量，說明延胡索是鎘敏感性植物。

植物抗氧化酶系統影響植株主要和次生代謝產物的積累[16]。在鎘脅迫處理下，3種主要的抗氧化酶指標均表現出顯著變化，說明延胡索的次生代謝系統受到鎘脅迫的嚴重破壞。隨著鎘脅迫濃度的增加，CAT和SOD的活性變化較小，說明CAT和SOD活性對鎘濃度不敏感。而低濃度鎘處理組的POD活性上升最為顯著，達到2 954.8 U·g-1(對照組POD活性為535.7 U·g-1)，但隨著鎘濃度的上升，POD活性逐漸下降，說明高濃度鎘破壞了POD酶分解毒素的系統。鎘脅迫處理極大地削弱了抗氧化酶系統對氧自由基的清除能力，導致膜脂過氧化，進而產出過量的MDA，損害膜功能，對細胞有極大的毒害作用。

測定了原阿片堿、小蘗堿、延胡索乙素和脫氫紫堇堿4種延胡索重要的生物堿在鎘脅迫下的變化情況，評價重金屬鎘污染對延胡索品質的影響。原阿片堿在鎘脅迫下含量下降，但不同濃度的鎘處理對原阿片堿的含量影響不大，說明原阿片堿的生物合成對鎘污染的程度不敏感。其中，小蘗堿含量受到鎘脅迫的影響最大，從對照組的54.3 μg·g-1降至300 μmol·L-1鎘處理下的18.4 μg·g-1，降幅接近70%。結果表明，鎘脅迫會影響延胡索主要活性物質的含量，進而影響延胡索藥材的品質。

本研究表明，重金屬鎘處理破壞了延胡索的抗氧化酶系統，影響延胡索次生代謝的進行。原阿片堿、小蘗堿、延胡索乙素和脫氫紫堇堿4種不同生物堿在鎘脅迫下含量均顯著下降，說明鎘脅迫降低了延胡索的質量，對延胡索的品質造成嚴重損害，延胡索大規模栽培應選擇在無鎘污染的土壤中進行。