豬肺炎支原體黏附因子P97蛋白研究進展

涂尾龍，吳華莉，黃濟，張鶯鶯，王洪洋，曹建國，衛金良，甘葉青，唐賽勇，談永松*

(1.上海市農業科學院 畜牧獸醫研究所，上海 201106；2.上海種豬工程技術研究中心，上海 201106；3.上海市嘉定區動物疫病預防控制中心，上海 201800)

豬氣喘病(EP)是由豬肺炎支原體(Mhp)引起的豬呼吸系統慢性傳染疾病[1]，具有高傳染性、高致病率、低死亡率的特性，尤其是冬季寒冷季節，豬氣喘病發病率高，影響生豬的存活率、生長速度等指標，造成重大的經濟損失，影響了養殖企業的經濟效益。早在1983年，Geary等[2]研究發現，Mhp細胞質中沒有致病因子，更深一步研究發現了Mhp致病的主要因素是細胞膜蛋白。張映等[3]于2002年研究豬肺炎霉形體及其膜致細胞病變，發現豬肺炎支原體的細胞膜對兔的腎細胞具有一定的毒性，更加證實了這種細胞膜蛋白的存在。Zhang等[4]研究發現，豬肺炎支原體致病因子黏附因子就是P97蛋白，其位于Mhp膜的表面，能夠特異地結合到豬呼吸道黏膜的纖毛上，引起豬氣喘病發作，在豬肺炎支原體致病中起關鍵作用。所以，本文從P97蛋白的分子結構、免疫原性、單抗制備和疫苗等方面進行闡述，為針對P97蛋白研制基因工程疫苗提供參考。

1 P97蛋白的分子結構

Tajima等[5]研究發現，利用超薄切片技術和電子顯微鏡觀察，Mhp莢膜為20 nm，能夠使得支原體黏附在纖毛的表面，從而造成了纖毛的脫落。Zhang等[6]最早利用單克隆抗體鑒定出黏附因子P97蛋白，其位于Mhp膜的表面，能夠黏附于呼吸道黏膜的纖毛上。1997年，Hsu等[7]經過對P97基因進行測序，發現P97編碼一個大小為124.9 ku的蛋白，然后其蛋白水解加工成為102.9 ku大小的蛋白，最后在聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上顯示大小為97 ku的蛋白。1998年，Hsu等[8]繼續對Mhp國際標準株232株的黏附因子P97基因克隆分析，發現P97主要功能區存在于C末端，包括含有15個重復基元(AAKPV/E)的R1區和4個重復基元(GTPNQGKKAE)的R2區。Minion等[9]利用免疫印跡技術對P97蛋白和纖毛結合的研究中發現，至少有8個P97蛋白R1區重復基元才能和纖毛結合，抗體識別需要至少3個重復基元。其中，P97蛋白的主要抗原決定簇區是在R1區，進一步發現了Mhp的黏附能力和致病力與R1、R2重復基元數量有十分密切的相關性[10-11]。王凱等[12]在構建豬肺炎支原體P97基因重組腺病毒時發現，P97基因由3 339個核苷酸組成，共編碼1 113個氨基酸。

2 P97蛋白的免疫原性

2003年，Shimoji等[13]利用P97 C末端構建了ErysipelothrixrhusiopathiaeYS-19菌株，然后滴鼻免疫仔豬，發現仔豬肺病變數量顯著減少，但在仔豬血清中沒有發現P97特異性抗體。這可能是因為單一抗原并不能有好的免疫原性，不能很好地保護仔豬免疫力，需要更多的抗原或者重組蛋白抗原誘導機體產生特異性抗體，需要進一步深入地對P97進行研究。2006年，Chen等[14]構建了重組的小鼠沙門氏菌Aroa CS332株疫苗，其攜帶了P97 R1，然后通過口服接種免疫，小鼠脾細胞能檢測到顯著的γ-干擾素，說明誘導了細胞介導的免疫反應。Ogawa等[15]對前者實驗進一步改良，通過皮下注射接種SC和口服Koganei株兩種方式免疫仔豬，效果非常顯著，能很好地保護仔豬，產生了特異性的IgA和IgG，也降低了仔豬肺部病變。2010年，Okamba等[16]利用P97重組缺陷腺病毒疫苗rAdP97c免疫仔豬，成功誘導出了兩種非常重要的P97特異性體液免疫和細胞免疫應答。2009年，陳超等[17]利用GenBank中的232株，擴增P97蛋白的C末端并得到了一個670 bp片段，然后克隆到pShttle-CMV載體上，構建了重組腺病毒質粒，經過Pac I酶切后轉染到AD293細胞，最后將純化的重組病毒通過肌注和滴鼻的方式接種小鼠，獲得特異性IgG，產生特異性的體液免疫和黏膜免疫，但不產生細胞免疫應答。2010年，盧會英等[18]通過將Mhp纖毛黏附區R1和大腸埃希氏菌中不耐熱腸毒素B亞單位(具有黏膜免疫佐劑功能)進行基因重組表達，構建了pET28a(+)-rLTBR1和pET28a(+)-rR1這兩個原核表達質粒，誘導表達得到了兩個融合蛋白rLTBR1和rR1。2015年，王凱[19]采用了PCR技術擴增Mhp毒株659的黏附因子P97，并對其進行測序，然后將其克隆在質粒pacAd5CMVK-NpA上，構建了其基因重組的腺病毒，結果發現，雖然重組P97蛋白Ad-P97不能在PK15細胞中增殖并引起細胞病變，但可以在Ad-P97蛋白上感染的AD-293細胞和PK15細胞中高效表達，說明重組蛋白Ad-P97具有良好的免疫原性，可以抑制Mhp對PK15細胞的黏附功能，可進一步誘導仔豬免疫基因組疫苗后產生Mhp凝集抗體。2020年，徐嫚[20]運用相關信息軟件技術，在Mhp183基因上篩選出一段大小為195 bp的核苷酸序列，將3段Mhp183195bp克隆到pET100載體上，在大腸埃希氏菌上進行表達，結果表明，成功得到30 ku蛋白，該蛋白對His-Tag鼠單抗和Mhp特異性血清都能產生特異性反應，具有良好的免疫原性。以上都說明，P97蛋白具有非常好的免疫原性，是研究Mhp基因重組疫苗的突破口和關鍵所在。另外，P97蛋白引起的免疫應答反應，能比其他抗原蛋白引起的免疫應答反應提前很長時間被檢測到，這對預防生豬EP有重大的防控意義。

3 P97蛋白的疫苗相關研究

目前，國內外Mhp疫苗已有上市，主要有4種：滅活苗、弱毒苗、基因工程苗和聯合疫苗。其中，滅活苗占據市場為主，基因工程苗和聯合疫苗大部分仍在研究階段。目前市場上有20多種滅活苗[21]，主要有PHARMGATE生產的Myco Gard和Myco Gard1、ELANCO生產的Myco shield和Stellamune Once、勃林格生產的茵格發、碩騰生產的瑞倍適、天康生物生產的天支凈和瑞普生物生產的優瑞適等，采用的毒株不一樣，效果也不一樣。上市的弱毒苗主要有168株和RM48株，免疫效果以細胞免疫和黏膜免疫為主[22]。

基因工程苗由于不需要添加病原，使用了DNA的重組技術，比傳統的滅活苗，尤其是弱毒苗要更安全，完全不同于傳統的商業疫苗，因此，是許多國內外研究的熱點。目前，國內外關于基因工程苗，大部分還是處于研發階段，還沒有商品上市，主要是因為基因工程苗比較復雜，需要對Mhp黏附因子開展詳細的研究。目前，研究人員針對Mhp黏附因子開展疫苗研究，其中主要研究的Mhp黏附因子有P97、P36、P42、P46和P95。目前有單黏附因子亞單位疫苗、腺病毒表達亞單位疫苗和重組沙門氏菌疫苗，詳細見表1[22-24]。

表1 Mhp黏附因子基因工程苗

我國很多學者也對P97基因工程疫苗展開研究工作。2019年，郭蕓蕓等[25]通過體外表達獲得了兩種重組蛋白pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1，與口蹄疫病毒滅活抗原混合免疫接種小鼠，檢測重組蛋白對口蹄疫滅活疫苗的增強效果，結果表明，混合接種小鼠血清中IgG明顯增加，重組蛋白混合接種小鼠，對口蹄疫疫苗有協同作用。韋艷娜等[26]通過把擴增得到的豬肺炎支原體P97基因融合至霍亂毒素B亞單位基因下游，構建了重組質粒pET-CTB-P97R1，然后與活疫苗免疫接種小鼠，檢測特異性抗體水平，結果表明，重組蛋白免疫多小鼠血清IgG抗體顯著高于對照組，能夠增強Mhp疫苗的免疫效力。陶宇[27]通過昆蟲桿狀病毒表達系統的表面展示技術，在桿狀病毒囊膜上同時表達豬肺炎支原體的P97 R1等蛋白，以及PCV2的Cap蛋白，并將得到的重組病毒蛋白rvAc-P97R1P46P42-Cap作為弱毒苗分別免疫小鼠和仔豬，小鼠產生特異性抗體IgG，脾淋巴細胞產生顯著的增殖效果，也同時能引起仔豬產生顯著的特異性抗體和細胞因子(IL-4和TNF-γ)，重組病毒蛋白具有較好的免疫原性。

4 小結

目前關于P97蛋白研究不少，已經達成共識的是，P97蛋白為Mhp的主要黏附因子，P97R1區是具有黏附纖毛的功能區，并有非常好的免疫原性。同時，將P97蛋白與其他Mhp抗原蛋白，甚至是其他病原疫苗進行重組，能夠提高機體的特異性抗體水平，增強免疫效力，同時還能起到協同作用。但P97蛋白使動物感染Mhp的機理及P97蛋白工程基因疫苗在臨床應用推廣的安全評價方面需要進一步進行動物試驗。