早實薄皮核桃根際與非根際土壤微生物多樣性分析

劉麗麗，李建輝，鄭雪良，陳駿，楊海英，王登亮

(1.衢州市農業林業科學研究院 果樹研究所，浙江 衢州 324000；2.衢州學院 環境工程系，浙江 衢州 324000)

核桃(Juglansregia)位列世界四大干果之首，屬于胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(Juglans)落葉喬木，素有“木本油料之王”的稱號，是我國主要的經濟樹種之一，具有極高的營養價值和良好的醫療保健效果[1]。近年來，早實薄皮核桃因其具有顯著區別于普通核桃的優良性狀而廣泛受到種植主體的歡迎，栽培面積不斷擴大。在早實薄皮核桃引種與推廣過程中，如何提高品質和產量一直是人們關注的焦點。從已有的研究來看，其產量的高低、品質的優劣與土壤立地條件密切相關[2-3]。然而，對早實薄皮核桃土壤立地條件已有的研究主要關注其土壤理化性質，對土壤微生物的研究迄今未見報道。

微生物是根際土壤的重要組成部分，與植物生長密切相關。根際土壤微生物會受到植物根系分泌物的影響，但其種類組成和多樣性也會影響植物的生長發育狀況，甚至決定植物的產量與品質[4]。有研究表明，根際土壤微生物群落結構失調會導致病原菌數量的增加，從而直接影響植株生長發育[5-6]。因此，了解早實薄皮核桃根際微生物群落結構和多樣性的變化，對評價土壤微生物對早實薄皮核桃的生長和品質的影響具有重要意義。為此，本文以浙江省衢州市引種的早實薄皮核桃為研究對象，基于Illumina MiSeq高通量測序技術，對早實薄皮核桃根際與非根際土壤微生物多樣性進行研究，探討兩者之間的區別，為進一步研究早實薄皮核桃的根際效應提供基礎數據，也為早實薄皮核桃的健康生長及在各地的引種與推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

早實薄皮核桃根際與非根際土壤樣品采集于衢州市農業林業科學研究院果樹所試驗基地，引進的品種為8518。選擇建園3 a、栽培管理措施相同、長勢基本一致的3株早實薄皮核桃，每株在距離樹干基部50 cm處隨機選取3個取樣點并混合后用于分析。采用內徑為10 cm的土鉆采集0～30 cm土層的樣品，收集直徑為0.1～0.5 cm的細根，用1 mm土壤篩經抖動法獲取根際土壤樣品。同時，在同一地塊中未種植薄皮核桃植株的空地上，采用“Z”字形方法隨機采集3份非根際土壤。將土壤樣品裝入已消毒密封塑料袋中帶回實驗室，置于-70 ℃冰箱中保存備用。

1.2 基因組DNA的提取和測序

采用OMEGA試劑盒提取土壤微生物基因組總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳并利用核酸定量分光光度計(NanoDrop，美國)檢測合格后置于-20 ℃保存備用。由杭州沃森生物公司通過Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序。細菌擴增引物為B341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和B785R(5′-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)；真菌擴增引物為ITS-3(5′-GATGAAGAACGYAGY RAA-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)。

1.3 數據分析

采用DPS統計軟件進行數據處理與分析，利用Duncan新復極差法(LSR)進行差異顯著性檢驗。在97%相似水平上對可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)進行分類分析，并在不同分類水平上統計種類組成。采用ACE指數、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數計算微生物多樣性[7-8]。使用Blast在NCBI數據庫(https://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db)進行比對，將優化序列根據數據庫中的參考序列在門、綱、目、科、屬的水平上進行鑒定，比較分析其種類組成和豐度。

2 結果與分析

2.1 根際與非根際土壤微生物質量

通過Illumina MiSeq高通量測序獲得了早實薄皮核桃根際與非根際土壤細菌和真菌群落的優化序列及其OTUs的信息(表1、表2)。雙端序列(reads)拼接和過濾后，共得到早實薄皮核桃根際與非根際土壤細菌和真菌分別為48 065和78 807條優化序列，其中根際土壤細菌和真菌分別為24 700和42 088，非根際土壤細菌和真菌分別為23 365和36 719，根際土壤細菌和真菌序列數分別比非根際土壤多1 335條和5 369條。基于大于等于97%的相似度水平，通過聚類分析細菌共獲得3 355個用于物種分類的OTUs，根際和非根際OTUs數量分別為1 718和1 637，兩者差異不顯著；真菌共獲得859個用于物種分類的OTUs，根際和非根際OTUs數量分別為489和370，兩者差異顯著。早實薄皮核桃根際土壤中細菌和真菌的OTUs數量均大于非根際土壤，表明與非根際土壤相比，根際土壤中細菌和真菌的物種更加豐富。

2.2 根際與非根際土壤細菌多樣性

2.2.1 細菌種類組成

早實薄皮核桃根際與非根際土壤中細菌相對豐度排名前3的門分別為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)，其中放線菌門在根際與非根際土壤中的相對豐度均達到30%以上；在綱分類水平上，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中均以放線菌綱的相對豐度最高，根際為36.62%，非根際為37.95%；從目分類水平來看，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中均以放線菌目的相對豐度最高。

2.2.2 細菌多樣性

從細菌多樣性分析結果來看(表1)，根際土壤和非根際土壤中測序覆蓋率均達97%以上，表明兩者測序的結果都可以反映其真實情況。生物多樣性指標中Shannon指數、Chao1指數和ACE指數的數值越大，說明被測樣品多樣性越高；而Simpson指數值越小，則說明生物多樣性越高。從表1可以看出，兩者的Chao1指數和ACE指數值都比較大，表明兩者的細菌豐富度都比較高，但兩者之間的差異未達到顯著水平；根際與非根際土壤Simpson指數相等，根際的Shannon指數略高于非根際，但兩者差異不顯著。由此可知，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中細菌豐富度總體較高，但兩者的多樣性未存在顯著差異。

表1 早實薄皮核桃根際與非根際土壤細菌多樣性指數

2.3 早實薄皮核桃根際與非根際土壤真菌多樣性

2.3.1 真菌種類組成

早實薄皮核桃根際與非根際土壤中真菌相對豐度均以子囊菌門最高，其中根際土壤達89.67%，非根際土壤達89.42%。在綱分類水平上，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中均以糞殼菌綱的相對豐度最高，其中根際土壤為53.65%，非根際土壤為30.40%。從目分類水平來看，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中均以肉座菌目相對豐度最高。從科分類水平來看，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中均以蜜環菌科的相對豐度最高。

2.3.2 真菌多樣性

從真菌多樣性分析結果來看(表2)，根際土壤和非根際土壤測序覆蓋率均達到99%以上，表明兩者測序的結果都可以反映其真實情況。在各項多樣性指數來看，Chao1指數和ACE指數均為根際土壤大于非根際土壤，且兩者差異顯著，表明根際土壤真菌豐富度大于非根際土壤；根際土壤真菌Shannon指數大于非根際土壤，而Simpson指數為根際土壤小于非根際，且兩者之間的差異均達到顯著水平。由此可見，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中真菌多樣性存在顯著區別，根際土壤真菌多樣性大于非根際。

表2 早實薄皮核桃根際與非根際土壤真菌多樣性指數

3 討論

與其他環境中生存的微生物相比，土壤生境中的微生物往往有著更高的物種豐富度和更復雜的群落組成，但根際土壤與非根際土壤往往有所區別[9]。有研究發現，土壤本身的理化性質和植物種類都能夠直接影響微生物的群落結構和多樣性[10-11]。本研究通過Illumina MiSeq高通量測序平臺對早實薄皮核桃根際與非根際土壤進行了宏基因組測序，獲得細菌和真菌序列。結果發現，早實薄皮核桃根際土壤細菌和真菌序列數分別比非根際土壤多1 335條和5 369條，根際土壤中細菌和真菌的OTUs數量均大于非根際土壤，這與李小林等[12]的研究結果基本一致。從Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數來看，早實薄皮核桃根際土壤中的真菌多樣性均顯著高于非根際土壤，但細菌多樣性之間差異不顯著，這可能是由于早實薄皮核桃根系分泌的某些化學物質是土壤的其他理化性質引起的，還需通過進一步試驗深入研究加以證實。

另一方面，根際土壤微生物群落結構與土壤健康狀況密切相關，其對植物的生長發育、抗逆能力、產量和質量等都會產生重要影響，根際土壤微生物群落結構失衡是引發病害的重要原因，因此，了解根際土壤微生物群落結構可為維護植物-土壤-微生物生態系統的相對穩定性提供重要參考[13]。本研究結果表明，早實薄皮核桃根際與非根際土壤中的真菌在門分類水平上均以子囊菌門占優勢地位，這與付亞娟等[14]對大花杓蘭的研究結果相似。從已有的研究來看，子囊菌門的某些微生物能夠改善植物的抗菌、抗氧化的作用，可增加植物的生物量，提高植株的抗病性，促進植株的生長[15]。本研究結果可為早實薄皮核桃的健康生長及引種和推廣提供理論依據。