TTC法測定菘藍種子生活力的優(yōu)化

吳紅，盧軍鋒，韓大雷，趙嘉豪

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院 園林園藝學院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇中藥科技園，江蘇 泰州 225300；3.民樂縣誠泰藥業(yè)有限公司，甘肅 民樂 734500)

菘藍(Isatisindigotica)為十字花科菘藍屬二年生草本植物，其干燥根入藥即為板藍根，有清熱解毒、涼血、利咽的功效；其干燥葉入藥即為大青葉，主治熱毒發(fā)斑、丹毒、咽喉腫痛、口舌生瘡、瘡癰腫毒等癥[1]。菘藍作為大宗藥材板藍根和大青葉的基源植物，在全國范圍內(nèi)廣泛種植。近些年來，市場上以菘藍根和葉為主要原料的板藍根顆粒、大青葉片、板藍根涼茶等銷售量大漲，對原藥材的需求急劇上升，導致中成藥生產(chǎn)及臨床應用供不應求的困境[2]。當前國內(nèi)對菘藍的化學[3]和藥理[4],以及栽培技術[5]等方面進行了研究，對種子的研究多集中在種子分級標準和種子逆境生理方面，如對菘藍種子抗旱性的研究[6]，鹽堿脅迫對菘藍種子萌發(fā)的研究[7]，微波輻射菘藍種子的生物學效應研究[8]。

目前關于菘藍種子生活力尚無專門的報道。種子生活力是指一定條件下種子維持生活力的最長期限，是指種子生命的有無，種子生活力有別于種子的萌芽率[9]，在菘藍的資源研究中我們發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽率的高低取決于種子的生活力和種子的休眠兩個方面，生產(chǎn)上菘藍主要以種子進行繁殖。種子生活力直接關系到種子的質量和經(jīng)濟效益，因此，在菘藍種子交易和種植過程中需要一種快速而準確的生活力鑒定技術。本試驗以菘藍種子為材料，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法，設置不同的染色時間、染色溫度、TTC濃度，采用單因素試驗和正交試驗設計，對菘藍種子生活力進行測定，并對測定方法進行優(yōu)化，以期為菘藍種子快速測定和種子質量檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

菘藍種子為植物學果實(角果)，本試驗所用種子(果實)采自甘肅省民樂縣三堡鎮(zhèn)(37°56′19″～38°48′17″N、100°22′59″～101°13′9″E，海拔2 029 m)，于2019年7月下旬整個果穗變紫色時剪下整個果枝，晾曬1～2 d后，碾壓、篩選，自然干燥后挑選飽滿種子置于牛皮紙袋內(nèi)存于0～4 ℃冷庫。次年初進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 種子處理

選取低溫保存的種子，去除雜質，先用自來水流水沖洗10 min，再用蒸餾水沖洗3次，將沖洗干凈的種子室溫下置于蒸餾水中浸泡12 h，加水量以沒過種子為宜。

1.2.2 種子染色

用手術刀劃開種皮，取發(fā)育良好、無損傷的種胚，置于磷酸緩沖液(pH 7.0)中保存?zhèn)溆?。染色時取出準備好的種胚，蒸餾水沖洗后用濾紙吸干表面水分，置于培養(yǎng)皿中，倒入TTC染色液溶液，染色液量以沒過種胚為標準，培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)結束后取出種胚，蒸餾水沖洗后濾紙吸干表面水分，最后根據(jù)染色深淺和染色面積大小判斷種子生活力。

1.3 處理設計

1.3.1 單因素試驗

染色溫度。菘藍種子吸水膨脹后，剝?nèi)⊥暾N胚60粒，置于培養(yǎng)皿中，每皿20粒，3次重復，加入濃度為0.5%的TTC溶液，后分別置于20、25、30、35和40 ℃的培養(yǎng)箱中染色2 h后測定菘藍種胚活力。

染色時間。菘藍種子吸水膨脹后，剝?nèi)⊥暾N胚60粒，置于培養(yǎng)皿中，每皿20粒，3次重復，加入濃度為0.5%的TTC溶液，置于30 ℃的培養(yǎng)箱中分別染色1、1.5、2、2.5和3 h后測定菘藍種胚活力。

TTC濃度。菘藍種子吸水膨脹后，剝?nèi)⊥暾N胚60粒，置于培養(yǎng)皿中，每皿20粒，3次重復，分別加入濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的TTC溶液，后置于30 ℃的培養(yǎng)箱中分別染色2 h后測定菘藍種胚活力。

1.3.2 正交試驗

在上述單因素試驗結果的基礎上，以染色溫度、染色時間和TTC濃度為因素，采用3因素3水平正交試驗設計法，考察影響菘藍種胚染色的主要因素，每皿20粒，3次重復。1、2、3水平，染色溫度分別為25、30和35 ℃，染色時間分別為1.5、2.0和2.5 h，TTC分別為0.3%、0.5%和0.7%。

1.3.3 染色后觀察

無色的TTC進入種子胚后，種子胚內(nèi)的細胞呼吸代謝產(chǎn)生的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)還原呈現(xiàn)紅色，對染色后的胚觀察并記錄，胚全部或絕大部分染成鮮紅色或大紅色為有生活力種子，只有少部分胚染色或大部分染色為淡粉紅色為低活力或無生活力種子。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel及DPS v7.05進行分析和作圖，各處理采用LSD法進行差異顯著性分析。

種子生活力=胚被染色的種子數(shù)目/供試種子數(shù)目×100%。

2 結果與分析

2.1 菘藍果實和種子形態(tài)特征

植物學上的種子和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的種子含義不同，本試驗采用種子是菘藍植物學上的果實(角果)，長圓形，扁平，翅狀，表面紫褐色或黃褐色，稍有光澤，先端微凹或平截，基部漸窄，具殘存的果柄或果柄痕；內(nèi)含1～2粒種子，為植物學上真正的種子，由胚珠發(fā)育而成。種子長橢圓形，成熟時表面黃褐色，基部具有一小尖突狀種柄，兩側面各具較明顯的縱溝(胚根與子葉間形成的痕)及一不甚明顯的淺縱溝(兩子葉之間形成的痕)，千粒重為8.74 g，種子縱徑比為2.03；種子由種皮和胚兩部分組成，種皮褐色膜質化，子葉為折疊型，子葉兩枚，較大，對折包在種皮中，背倚于胚根，胚根圓柱狀(圖1)。

圖1 菘藍果實、種子和胚形態(tài)

2.2 菘藍種子生活力測定單因素試驗

由表1可以看出，在20～40 ℃溫度下，隨著TTC染色溫度的增加菘藍種子的生活力也增加，在40 ℃時達最大，為71.42%；其后依次為35 ℃和30 ℃處理，分別為70.18%和68.31%；生活力最小的是20 ℃處理，生活力為50.88%，25 ℃處理時生活力為60.48%，方差分析表明20 ℃、25 ℃和30 ℃處理之間差異達極顯著水平；在20～40 ℃溫度內(nèi)，隨著TTC染色溫度的增加，種胚顏色逐漸加深，從粉色、粉紅色再到紅色，但在40 ℃時種胚呈現(xiàn)深紅色，表明種胚生活力下降。因此，本研究表明，菘藍種子生活力測定的TTC最佳溫度為30～35 ℃。

表1 菘藍種子生活力與染色溫度的關系

由表2可以看出，在1～3 h隨著TTC染色時間的延長，菘藍種子的生活力也增加，在染色3 h時生活力為80.68%，與染色2.5 h(80.39%)結果接近，且方差分析表明兩組間差異不顯著；在1.0～2.5 h處理時生活力增加幅度較大，方差分析表明各處理之間差異極顯著；顯色結果表示，TTC染色2.5 h時種胚顏色呈紅色，但在3 h時種胚呈現(xiàn)深紅色，表明種胚生活力開始下降。因此，本研究表明，菘藍種子生活力測定的最佳TTC染色時間在2.5 h左右。

表2 菘藍種子生活力與染色時間的關系

由表3可以得出，菘藍胚的生活力隨著TTC濃度的升高而升高，在0.1%～0.5%，增加幅度較大，方差分析表明TTC濃度為0.1%～0.5%，各處理組間生活力差異達極顯著水平；TTC濃度在0.5%～0.9%，各處理組生活力增加幅度較?。簧盍ψ钚〉氖荰TC濃度為0.1%處理組，種子生活力為46.51%；顯色結果表示，TTC濃度0.5%～0.7%時種胚顏色呈紅色，但在0.9%以上時種胚呈現(xiàn)深紅色，表明種胚生活力開始下降。因此，本研究表明，菘藍種子生活力測定的最佳TTC濃度在0.5%～0.7%。

表3 菘藍種子生活力與TTC濃度的關系

2.3 菘藍種子生活力測定正交試驗

染色時間、染色溫度和TTC濃度是影響種子生活力快速測定效率的主要因素[10]，本試驗在分析單因素試驗結果的基礎上，選擇以上3個因素進行三水平正交試驗設計，從而優(yōu)化菘藍種子TTC染色法的技術參數(shù)(表4)。

表4 正交試驗結果

不同處理組染色結果表明，菘藍種子生活力介于60.13%～85.29%，其中以0.5%的TTC溶液在30 ℃條件下、染色2.5 h種子生活力最高，染色效果也最好，明顯優(yōu)于其他處理組合；而組合0.3%的TTC溶液在25 ℃條件下、染色1.5 h種子生活力最低，染色較淺，效果較差。

對正交試驗設計進行方差分析，結果表明，3個因素的P值均小于0.001，表明染色時間、染色溫度和TTC濃度對種子活力的測定都有極顯著影響，3個因素的極差值分別為11.67、7.42和4.93，即3個因素對菘藍種子生活力的影響大小依次為染色時間、染色溫度、TTC濃度，染色時間對菘藍種子生活力影響最大，而TTC濃度影響最小。

3 小結與討論

3.1 TTC法測定菘藍種子生活力的最佳條件

種子生活力是衡量種子貯藏方式是否適宜以及播種品質優(yōu)劣的重要指標，種子生活力測定方法多樣，不同的測定方法測定結果也不盡相同[11-12]。本試驗中供檢菘藍種子的生活力達85.29%，染色時間過短(<1.5 h)時，種子染色較淺，不適于菘藍種子生活力測定，可能是因為短時間內(nèi)種子呼吸產(chǎn)生的H+有限，無法完成還原反應所致；但在較長時間(>2.5 h)、較高溫度(>35 ℃)和較高濃度(>0.7%)時菘藍種子生活力反而下降，可能是種子長時間處于較高濃度和較高溫度的染色條件下，種胚內(nèi)部結構遭到破壞或種胚內(nèi)酶失活所致；根據(jù)正交試驗結果，菘藍種子在30 ℃的0.5%的TTC溶液中染色2.5 h種子生活力最高，為其生活力測定的最佳方法。

3.2 TTC法測定菘藍種子生活力的可行性

TTC染色法測得生活力一般與發(fā)芽率測定一致，有時會高于發(fā)芽率[13]，本試驗采用的是當年新采集的菘藍種子，采集時含水量為8.60%，種子發(fā)芽率為82.55%，TTC染色后種子生活力達到85.29%，略高于種子發(fā)芽率，本研究結果與向振勇等[14-16]研究結果一致，采用TTC染色法測定種子生活力，從種子精選、浸種到種子染色需要18～20 h，而實驗室測定種子的發(fā)芽率一般需要5～6周，因此，TTC染色法可實現(xiàn)菘藍種子的快速測定。TTC染色法是公認的生活力測定方法，已正式列入我國《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》的生活力測定。本試驗在單因素試驗的基礎上，通過多因素多水平組合試驗得出探究性試驗結果，具有較強的說服力和科學性，可以很好地應用于生產(chǎn)實踐。