基因檢測微流控芯片的研究、應用與發展

劉 宇， GIUSEPPINA SIMONE

(西北工業大學空天微納系統教育部重點實驗室，陜西 西安 710072)

0 引 言

基因(DNA)是人類的遺傳密碼，從根源上控制著人的生老病死，人類基因組計劃的正式完成，極大地推動了基因檢測等技術的發展，為人類了解生命本質以及預防疾病提供了方法。但傳統的生化檢測、染色體分析、DNA分析等基因檢測技術往往具有操作難度高、成本高、耗時長、準確度低及性價比低等缺點[1]。而微流控技術很好地解決了這些問題。

微流控是一種全新微量分析技術，具備小劑量分析、快速、低成本、可集成等優勢[2]。目前，微流控芯片的應用已經遍及生命科學、醫學、化學等領域，相關技術、器件和工藝發展迅速[3]。本文重點對近幾年國內外基因檢測微流控芯片的研究與應用進行了綜述，并對其未來的發展趨勢進行了展望。

1 基因檢測與微流控檢測技術優勢

基因檢測通常包括提取、擴增和檢測三個步驟，傳統的基因芯片的工作原理是核酸分子雜交。即制造一個靶基因cDNA片段按特定規律排布的支持物，然后將從體液、唾液等中提取的被檢測的DNA或RNA通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增，并摻入熒光標記分子探針，然后，根據堿基互補配對原理檢測熒光標記，從而獲得被檢測基因的相關信息。

微流控芯片可以在很短的時間內提取、擴增和檢測DNA。將微流控芯片技術應用于基因檢測領域具有以下優勢：1)降低污染風險：人工操作DNA提取耗時長且測試過程容易受到污染，而集成的微流控芯片可以自動完成各項操作，減少樣本污染。2)高通量：微流控芯片可以設計多條微通道[4]，同一個微流控芯片可以對同一樣本同時進行不同項目的檢測，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。3)試劑消耗少、時間短：非常少的樣本和檢測試劑即可進行高精度的測試，且由于微流控芯片的微型化提高了傳熱效率[5]，因此可以更短的反應時間促進DNA擴增，并且由于短的擴散距離，具有更高的響應速度，縮短反應時間。4)操作難度低：集成芯片中的各檢測步驟可以全自動進行，降低了傳統基因檢測的難度。5)成本低：與傳統實驗室中笨重且昂貴的設備相比，大規模生產技術集成生產的微流體芯片大大降低了生產成本。

2 基因檢測微流控芯片的研究現狀

2.1 微流控芯片的制作材料

用于制作基因檢測微流控芯片的材料主要有單晶硅、石英和玻璃、高分子聚合材料，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。單晶硅是最早適用芯片的基材，加工工藝及設備完善，但硅材料易碎、價格貴、絕緣性差、對PCR反應有抑制作用[6]。石英和玻璃具有很好的抗腐蝕性，且廉價易得，但其加工工藝復雜，也逐漸被人們舍棄。PDMS是目前使用量最多的高分子聚合物材料，其兼具成本低廉、生產規?；忍攸c，并且具有很好的生物相容性和熱穩定性，但其加工工藝較為復雜[7]。

除了傳統的制作材料外，紙張也是一種很好的制作微流控芯片的原材料，紙微流控芯片從提出至今雖然只有幾十年的發展歷程，但其成本低、制作簡單、具有很好生物相容性[8]，逐漸受到人們的青睞。除此之外，基于紙張的微流控芯片無需外加驅動裝置，可以利用自身的毛細力輸送流體。Trieu P T等人[9]研究了一種集成了DNA純化、環介導等溫擴增和現場比色檢測的紙質微流控芯片，紙張先通過互補模具壓花雕刻理想的幾何形狀，然后用PDMS進行疏水涂層。

2.2 微流控芯片的制作方法

基因檢測微流控芯片的制作方法與主流微流控芯片相同，不同的材料具有不同的制造工藝。硅、玻璃等材料微流控芯片上的微細結構主要采用光刻和蝕刻技術進行加工。高分子聚合材料芯片上的微細結構一般采用模塑法、注塑法、熱壓法、軟光刻、激光燒蝕法等方法制造。近年來，3D打印和絲網印刷技術等新型加工技術開始受到研究者的廣泛關注。

3D打印是一種可以在精確的控制下，逐層構建3D物體的增材制造技術，其中可應用于微流控器件制造的是：1)立體光刻;2)多射流建模;3)熔融沉積建模[10]。3D打印技術不但克服了傳統制造技術的障礙，而且實現了低成本、快速、一步三維制造[11]，具有廣泛的應用前景。

2.3 微流控芯片的驅動方式

2.3.1 微泵驅動

微泵分為機械式和非機械式。機械式微泵主要通過固體或液體運動產生的壓差來驅動流體，非機械式微泵主要通過能量傳遞來驅動流體運動[12]。任芳玲等人[13]利用高密度雙錐納米孔(孔徑約為30 nm)的徑跡刻蝕薄膜制成了厚度約為12 μm的高性能低壓電滲泵芯片，并表現出良好的穩定性。中國科學技術大學的孫仕欣等人[14]基于三腔蠕動微泵的液體回流問題，開發了一種五腔壓電蠕動微泵。

2.3.2 磁珠驅動

磁珠驅動的原理是通過操控外加磁場來操控吸附核酸分子的磁珠，從而實現微流體的驅動，其中磁場主要是通過永磁體、電磁體和軟磁體來產生[15]。鄭州大學的杭躍航等人[16]設計了一種用永磁體產生磁場的表面開放的一體化液滴微流控芯片(圖1)，可實現核酸檢測的全過程。武漢大學的張作然等人[17]利用了微流控芯片上側向磁泳的方法，同時分選了乙型肝炎病毒DNA和丙型肝炎病毒反轉錄DNA。

圖1 永磁體微流控芯片結構[16]

2.3.3 離心力驅動

離心力驅動的原理是利用一個電機來產生流體流動所需要的力，相較于其他驅動類型的微流控芯片，離心驅動更多地應用于樣品制備的步驟[18]。結合重組酶介導擴增技術，周新麗等人[19]開發了一種集核酸擴增與檢測一體的扇形微流控芯片，該扇形微流控芯片受離心力控制。由于該扇形微流控芯片具有多個微小腔室，能夠同時檢測多個樣本的多種指標。

2.3.4 其他驅動方式

Li X等人[20]開發了一種利用拉伸力作為驅動方式的核酸檢測微流控芯片，該芯片由3個經不同方式處理的PDMS層制成(圖2(a))，樣品溶液通過毛細管作用進入微流體通道，應變閥在拉力的作用下打開并產生負壓，樣品溶液和檢測溶液在彈簧泵流道混合并通過彈簧泵產生的動力驅動流體流入檢測室(圖2(b))，在核酸擴增的過程中，會釋放氫離子導致溶液pH值下降，檢測液種的pH指示劑的顏色隨之變化，從而實現對核酸的檢測。

圖2 拉伸式核酸檢測微流控芯片[20]

3 微流控芯片在基因檢測中的應用

3.1 臨床醫學診斷

3.1.1 遺傳病篩查

單核苷酸多態性(SNP)的基因分型是分析許多遺傳病的基礎。基于SNP分型方法，Lu Y等人[21]提出構建了一種多腔室微流控芯片，用于檢測遺傳性聽力損失。樣品在多腔室獨立進行等位基因特異性PCR，很好地解決了現有SNP檢測方法檢測周期長、操作繁瑣、殘留污染風險高的問題。

3.1.2 癌癥診斷

外分泌體及其伴隨的蛋白質和核酸被認為是腫瘤診斷的生物標志物，因此，對外分泌體的檢測成為了區分癌細胞和正常細胞的重要手段[22]。Qian C等人[23]開發了一種名為isExoCD的瓊脂糖微流控芯片，并將外分泌體濃縮和microRNA(miRNA)檢測集于一體，入口處加載的目標外分泌體利用毛細管效應和瓊脂糖凝膠的透水性自動富集。Gao Y等人[24]提出了一種特異性miRNA定量檢測平臺，基于三段雜交同時對多個樣品中的miRNA進行多重檢測，用于乳腺癌的早期診斷。羅丹等人[25]開發了一種對人血漿外泌體中miRNA—21測定的凝膠電泳微流控芯片，對推動外泌體與腫瘤相關研究具有重要的價值。

3.2 病原體檢測

傳統用于細菌檢測方法的平板計數法由于耗時長和靈敏度等問題已經無法滿足日益增長的食品安全檢查要求[26]。環介導等溫擴增(LAMP)技術已成為一種非常有前景的快速靈敏檢測病原體的方式[27]。Teixeira A等人[28]將LAMP技術與表面增強拉曼散射相結合開發了的微流控器件實現了對李斯特菌的檢測。Jin J等人[29]開發了一種集成LAMP的雙樣本檢測微流控芯片，可同時完成兩個樣本的22次基因分析，顯著提高了檢測效率。Yin K等人[30]建立了一種SMCD(多路比色檢測)方法用于檢測廢水中的嚴重急性呼吸綜合征狀病毒2型(SARS—Cov—2)，SMCD方法在3D打印的微流控芯片上集成了核酸提取，等溫擴增和比色檢測，通過智能手機分析記錄的實時比色信號便可檢測到廢水中的SARS—CoV—2病原體。

3.3 生物化學研究

基因檢測微流控芯片為體外基因改造分析提供了可能。Wang W等人[31]開發了一種可以對一些化學試劑和輻射對DNA的損傷作用進行評估的微流控芯片(圖3(a))，并對工程菌進行了相關實驗，對維護長期暴露于太空環境的宇航員的安全和健康提供了基礎數據?？紤]到微生物耐藥性的日益增強對全球公共衛生的威脅，Rodriguez—Manzano J等人[32]開發了基于LAMP的核酸檢測微流控芯片設備檢測活動性粘菌素的耐藥性(圖3(b))。

圖3 用于生化分析微流控設備實物

4 關鍵問題與未來發展

4.1 制造材料

制作微流體的理想材料需要具有光學透明性、機械強度高、熱穩定性好、易于加工且適合大規模生產，但沒有一種材料能同時滿足所有這些要求。因此,可以將硅、玻璃、陶瓷、紙張和高分子材料協同使用構造混合器件，發揮其各自的優勢。

4.2 3D打印技術

3D打印作為一種新型快速成型技術，具有加工速度快、成本低等優點，目前已經廣泛應用于制造微流控芯片的各個領域。但3D打印低的分辨率以及有限的印刷材料限制了其應用。為了實現高分辨率微流控芯片的快速制造，需要發展基于表面投影和逐層光固化的高精度數字光處理(digital light processing,DLP)3D打印技術。相較于傳統制備方法，DLP 3D打印技術具有更快的速度、更高的通道精度和更好的安全性能。

4.3 驅動方式

基因檢測微流控芯片在工作時通常需要加熱模塊對核酸進行擴增和外置驅動裝置驅動流體檢測，但是，對于一些缺乏資源的偏遠地區，無法滿足床旁檢測檢測要求。為了實現這類地區的基因檢測，可以發展利用人體自身熱量驅動核酸擴增的技術，并在此基礎上，結合利用毛細作用驅動的紙基微流控芯片，開發利用人體熱量驅動的可穿戴紙基基因檢測微流控芯片。

5 結束語

1)微流控芯片在基因檢測領域的應用，極大提高了基因檢測的靈敏度和效率，但微流控芯片的制造材料、制造方法和驅動方式仍是當今研究的重點和難點。

2)目前微流控芯片在基因檢測中的應用包括臨床醫學診斷、病原體檢測、生物化學研究和藥物篩查。其中臨床醫學診斷的應用主要集中在遺傳病篩查和癌癥診斷，微流控芯片的應用很好地改善了傳統篩查診斷方式的耗時長、靈敏度低等不足。