乙醇梭菌蛋白的分級提取工藝優化

柳入銘，張朝輝

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266005）

單細胞蛋白（single cell protein，SCP）大部分來自于細菌和酵母，其不但與魚粉具有相似的賴氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸含量，還具有較高比例的色氨酸和蘇氨酸[1]。SCP是一種高品質蛋白質的替代來源，在畜產和水產養殖中已經得到了廣泛應用[2]，并且它可以作為富含蛋白質食物的替代品[3]，可以替代傳統（植物和動物）蛋白質來源，而不會產生有害影響[4]。

乙醇梭菌蛋白就是一種新型單細胞蛋白源，是以乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）為發酵菌種生產的一種新型菌體蛋白[5]，代謝快、生產率高、成本較低且蛋白質含量高，蛋白質含量可達80%，超過了進口魚粉，并含有豐富的必需氨基酸[6]。尹秀娟等[1]用3%的單細胞蛋白和蛋白肽替代魚粉，發現可以使斷奶仔豬獲得與使用魚粉時相似的生長性能、養分消化和腸道形態。吳雨珊[7]對乙醇梭菌蛋白與傳統蛋白源豆粕、棉粕、菜粕和酒糟蛋白（distillers dried grains with solubles，DDGS）進行對比分析，發現乙醇梭菌蛋白的蛋白含量高、蛋白溶解度高、吸水性強，其制粒性能優于其他4種蛋白源。陳穎[8]用乙醇梭菌蛋白替代飼料中不同比例的魚粉，發現其對生長性能、抗氧化能力和消化酶活性等未見明顯的不良影響，并且可以明顯降低氮磷排放量。

乙醇梭菌蛋白與傳統植物源性蛋白質相比，其不含抗營養因子，而相對于動物源性蛋白質來說，其生產具有綠色、節能、環保的特性，沒有致病性，因此具有廣闊的開發前景。目前我國廣泛使用的動物蛋白源主要是豆粕、花生粕、魚粉等，每年依靠進口大量的大豆來做飼料，成本很高[9]，而且近年來魚粉供求關系緊張，因此解決該困境的重要途徑之一就是合理地開發和利用動植物蛋白源[10]。

蛋白質的提取分離對于研究蛋白質非常重要，提取分離方法主要包括咪唑法、電泳法、苯酚提取法等[11]，其中超聲技術可以通過聲波的影響來提高提取效率，也可用于增強蛋白質功能性質，是一種安全、低成本、可靠、可復制、無創性而又不會污染環境的提取方法，與傳統的萃取方法相比有著很大的優勢[12-13]。Osborne分級法是根據蛋白質的溶解性進行分級提取的一種方法，簡單便捷易于操作，并且可以有效分離不同溶解性的蛋白質，孫媛[14]通過改良Osborne分級法為小麥麩皮的高值利用提供了新路徑；姜燕蓉等[15]也曾用此方法成功提取牡蠣蛋白，該方法可以根據溶解性質的不同將蛋白質分級成水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶蛋白（溶于50%～90%的乙醇溶液）和堿溶性蛋白[16]，對蛋白質可以進行較好地分離。

乙醇梭菌蛋白價值很大、前景廣闊，但國內外的各種研究報道較少，因此本研究擬通過Osborne分級法對乙醇梭菌蛋白進行分級分離，并對其含量最高的蛋白質種類進行提取條件的優化，探究超聲溫度、超聲時間、料液比以及溶液濃度對其提取率的影響，為乙醇梭菌蛋白的后續開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乙醇梭菌蛋白：北京首鋼朗澤新能源科技有限公司；蒸餾水：上海康力士分析儀器有限公司；硫酸鈉、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白標準液：碧云天生物技術有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

CP413精密天平：上海奧豪斯儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-300DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；2-16KL臺式高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；ALPHA 1-4 LD Plus冷凍干燥機：德國CHRIST公司；MULTISKAN Sky全波長酶標儀：美國Thermo scientific公司，Heal Force凈水系統：上海康力士分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Osborne分級法提取乙醇梭菌蛋白

稱取一定質量的乙醇梭菌蛋白粉末，將蒸餾水按料液比1∶15（g/mL）加入其中，在30℃、100 W的條件下超聲輔助提取20 min，在4℃、8 000 r/min的條件下離心20 min，對得到的上清液進行旋蒸濃縮、冷凍干燥后得到水溶性蛋白，離心得到的沉淀中按料液比1∶15（g/mL）加入2%硫酸鈉溶液，在相同條件下進行超聲離心，所得上清液進行冷凍干燥得到鹽溶性蛋白，之后在離心得到的沉淀中按料液比1∶15（g/mL）加入70%乙醇溶液，在相同條件下進行超聲離心，所得上清液進行濃縮、冷凍干燥后得到醇溶性蛋白，向離心得到的沉淀中按照料液比1∶15（g/mL）加入2%氫氧化鈉溶液，超聲離心，所得上清液濃縮、冷凍干燥得堿溶性蛋白[17-18]，具體工藝流程見圖1。記錄分類后進行各蛋白組分含量[19]的計算，之后再對含量最多的蛋白質種類進行進一步研究。

圖1 乙醇梭菌蛋白分級提取工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of fractionated extraction of Clostridium autoethanogenum protein

1.3.2 標準曲線制作

采用牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）作為蛋白質標準品[20]制作標準曲線。具體方法為準確吸收5.00 mg/mL牛血清蛋白標準液于試管中，分別以蒸餾水稀釋，配成 0、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500mg/mL的牛血清蛋白標準液，空白對照組以蒸餾水代替，之后各吸取5 μL于96孔板中，再于各孔中加入250 μL考馬斯亮藍G-250試劑，2 min后在酶標儀上于595 nm處測吸光值，制作蛋白標準曲線。

1.3.3 單因素試驗

針對Osborne分級法分離出的蛋白質含量最高的堿溶性蛋白進行單因素試驗，研究超聲時間、氫氧化鈉溶液質量分數、超聲溫度和料液比對蛋白得率的影響。

1.3.3.1 超聲時間對蛋白得率的影響

準確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末7份，在2%氫氧化鈉溶液中以料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度35℃、超聲功率100W的條件下，探究超聲時間15、20、25、30、35、40、45 min 對堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.3.2 氫氧化鈉溶液質量分數對蛋白得率的影響

準確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度35℃、超聲功率100 W、超聲時間20 min的條件下，探究氫氧化鈉溶液質量分數為0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%對堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.3.3 超聲溫度對蛋白得率的影響

準確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在2%氫氧化鈉溶液中以料液比1∶20（g/mL）、超聲時間20 min、超聲功率100 W的條件下，探究超聲溫度25、30、35、40、45、50 ℃對堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.3.4 料液比對蛋白得率的影響

準確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在2%氫氧化鈉溶液中以超聲溫度35℃、超聲功率100 W、超聲時間20min條件下，探究料液比 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）對堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，采用L9（34）正交設計對乙醇梭菌蛋白中堿溶性蛋白的提取條件進行優化，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor level table of orthogonal test

1.3.5 蛋白得率的計算

通過考馬斯亮藍染色法[21]，測定595 nm處的吸光值，根據標準曲線計算出相應的蛋白濃度，根據不同提取條件下的提取液，計算得到相應的蛋白得率[22]，具體計算方法如下。

式中：c為乙醇梭菌蛋白堿溶性蛋白濃度，g/mL；v為溶液體積，mL；m為乙醇梭菌蛋白質量，g。

1.3.6 數據處理

試驗設置3個重復，每個單因素試驗進行3次平行試驗。試驗數據采用Microsoft Excel軟件進行制圖，利用SPSS 17.0進行數據分析，通過單因素分析、F檢驗對各因素水平進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乙醇梭菌蛋白的Osborne分級法分類結果

通過Osborne分級法對乙醇梭菌蛋白進行分級提取后，得到的各類蛋白含量見圖2。

圖2 Osborne分級法提取后各類蛋白含量Fig.2 Content of various proteins after Osborne classification

由圖2可知，按照Osborne分級提取的方法提取得到的4種蛋白中，水溶性蛋白占蛋白質總含量的3.43%、鹽溶性蛋白占0.21%、醇溶性蛋白占0.04%、堿溶性蛋白占76.80%。其中含量最多的為堿溶性蛋白，因此后續對堿溶性蛋白進行進一步的研究，研究堿溶性蛋白的最佳提取條件。

2.2 標準曲線的制作

牛血清蛋白標準曲線見圖3。

由圖3可知，以牛血清蛋白濃度為橫坐標，以595 nm處的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.751 7x+0.692 7（R2=0.996 7），線性關系良好。

圖3 牛血清蛋白標準曲線Fig.3 Bovine serum protein standard curve

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 超聲時間對提取結果的影響

超聲時間對堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖4。

由圖4可知，在15 min～30 min時，蛋白得率隨著超聲時間的延長逐漸上升，但趨勢較為緩慢，到35 min時蛋白得率達到最高，之后開始下降，這可能是因為適宜的超聲時間可以一定程度上促進蛋白質的提取，但隨著超聲時間的延長容易導致蛋白質變性，從而導致得率在一定程度上下降[23]。通過單因素分析可看出15min與35min有明顯差異，因此選擇30、35、40 min 3個水平進行正交試驗。

圖4 超聲時間對蛋白得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction yield

2.3.2 氫氧化鈉溶液質量分數對提取結果的影響

氫氧化鈉溶液質量分數對堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖5。

圖5 氫氧化鈉溶液質量分數對蛋白得率的影響Fig.5 Effect of mass fraction of sodium hydroxide solution on extraction yield

由圖5可知，氫氧化鈉溶液質量分數在0.3%～0.5%時，蛋白得率隨著質量分數的增加逐漸升高，0.5%時蛋白得率達到最大，之后整體呈下降趨勢，由此可見，隨著氫氧化鈉溶液質量分數的增加，堿溶性蛋白得率也升高，但繼續增加得率反而下降，分析可能是隨著氫氧化鈉溶液質量分數的上升，改變了蛋白質對水的親和性和表面帶電荷狀況等[24]，在低濃度的堿溶液中，由于效應離子強度增加，增強了蛋白質分子與水分子之間的相互作用，進而使蛋白質的溶解度增加[25]，但增長有一定的限度，再增加氫氧化鈉濃度可能會導致此蛋白質變性，從而使提取率下降。因此選擇0.3%、0.5%、1.0%3個水平進行正交試驗。

2.3.3 料液比對提取結果的影響

料液比對堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖6。

圖6 料液比對蛋白得率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield

由圖6可知，料液比在1∶15（g/mL）～1∶30（g/mL）時蛋白得率隨著溶液體積的增加逐漸升高，但增長緩慢，到1∶35（g/mL）時達到最大，之后稍微有所下降，這可能是因為溶液體積較小時，溶液較黏稠，溶出率較小，因此得率不高，之后隨著溶液體積的增大，蛋白質在更多溶劑中的分散作用使蛋白質的提取量有所增加[26]，但隨著溶液體積增大，分散度已經達到最大，再增加已經不會有更好的提取效果，反而有可能受到一定的抑制作用。因此選擇1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）3個水平進行正交試驗。

2.3.4 超聲溫度對提取結果的影響

超聲溫度對堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖7。

圖7 超聲溫度對蛋白得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield

由圖7可知，在25℃～45℃時，蛋白得率隨著超聲溫度的升高而升高，在50℃有所下降，在45℃，時蛋白得率達到最高，之后蛋白得率開始下降，這可能是因為維持蛋白質各亞基之間的空間構象的各類次級鍵因分子劇烈運動而破壞[27]，溫度達到一定程度會導致蛋白質變性或熱降解從而使蛋白得率不再增加[28]。因此選擇40、45、50℃3個水平進行正交試驗。

2.3.5 正交試驗結果

正交設計結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交設計結果Table 2 Orthogonal design results

表3 正交設計方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal design

由表2可知，通過極值R大小得出各因素對蛋白得率影響大小為超聲時間＞氫氧化鈉溶液質量分數＞料液比＞超聲溫度。由表3可知，本試驗超聲時間對堿溶性蛋白的蛋白得率影響為極顯著（p＜0.01），氫氧化鈉溶液質量分數對得率的影響顯著（p＜0.05），提取溫度和料液比對得率有一定影響（p＜0.25），結果不顯著[29]。綜合分析得到堿溶性蛋白的最佳提取工藝參數為A3B2C1D1。

2.4 驗證試驗

準確稱取一定量乙醇梭菌蛋白粉末3份，按最佳工藝參數A3B2C1D1進行超聲輔助提取，測量其吸光值，算出其蛋白得率為75.75%。蛋白得率大于其他提取工藝參數，因此選擇A3B2C1D1為最佳工藝參數，此時得率75.75%。

3 結論

本研究通過Osborne分級法提取乙醇梭菌蛋白并進行了提取分類，最終分級為水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白以及堿溶性蛋白4種蛋白，水溶性蛋白占蛋白質總含量的3.43%、鹽溶性蛋白占0.21%、醇溶性蛋白占0.04%、堿溶性蛋白占76.80%。由此可知，堿溶性蛋白含量最多，具有研究價值，因此后續的條件優化以堿溶性蛋白作為研究對象。

根據單因素試驗結果以及正交試驗對乙醇梭菌蛋白中的堿溶性蛋白進行了提取優化，探究超聲溫度、料液比、超聲時間以及氫氧化鈉溶液質量分數對堿溶性蛋白的蛋白得率的影響，最終得到最佳工藝參數為超聲溫度50℃、料液比1∶35（g/mL）、超聲時間為30 min、氫氧化鈉溶液質量分數為0.3%，此時蛋白得率為75.75%。

乙醇梭菌蛋白擁有廣闊的開發前景，是一種可以代替植物和動物蛋白源的優質蛋白源，但目前國內外對于乙醇梭菌蛋白的研究都非常少，乙醇梭菌蛋白的結構及活性探究方面還需要進一步的研究，因此該試驗可以為乙醇梭菌蛋白在飼料及功能性食品等方面的開發利用提供一定的試驗依據，給后續研究以一定的參考，有利于其進一步的研究與開發。