米曲霉固體發(fā)酵核桃粕條件優(yōu)化

賈晉茹，徐萌，韓軍，裴家偉，田益玲，2，3，何俊萍*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省（邢臺(tái)）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 邢臺(tái) 054000；3.河北省核桃工程技術(shù)中心，河北 邢臺(tái) 054000）

核桃又名胡桃，作為我國的一種優(yōu)良經(jīng)濟(jì)作物，在2017年其產(chǎn)量就高達(dá)385萬噸，產(chǎn)值達(dá)933.4億元[1-2]。核桃除可以鮮食外，主要是被用來榨油，核桃油以其豐富的不飽和脂肪酸被世人所推崇[3-4]。就在核桃油暢銷的同時(shí)，也面臨著核桃粕的處理與應(yīng)用的問題。核桃粕中的蛋白質(zhì)含量豐富，占其干重的43%以上，含有的18種氨基酸中有8種必需氨基酸與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）推薦的人體氨基酸模式相近，被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)蛋白[5-6]。但目前核桃粕整體利用率低下，基本被用作動(dòng)物飼料或直接丟棄，不僅造成環(huán)境污染，還導(dǎo)致大量蛋白資源的浪費(fèi)[7-9]。所以對(duì)核桃蛋白進(jìn)行發(fā)酵降解，進(jìn)一步提高核桃粕的綜合利用價(jià)值，對(duì)核桃資源的開發(fā)與利用具有重要意義。蛋白酶是原料降解過程中的重要酶類，決定著生成氨基酸、短肽、多肽的多寡，關(guān)系著原料的充分利用與否[10]。而米曲霉是目前微生物發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶最重要的菌株，其生長(zhǎng)迅速，使用方便，對(duì)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境要求低，是表達(dá)外源蛋白的理想宿主[11]。米曲霉的基因組中含有135個(gè)胞外蛋白酶基因，其胞外蛋白酶系非常復(fù)雜，主要是通過頂端分泌的方式分泌到胞外，并且在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生毒素，是分解各類蛋白的最佳選擇[12]。其產(chǎn)生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，由于在發(fā)酵期間不同蛋白酶之間交替發(fā)生作用，往往能夠賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味[13]。蛋白酶的酶活性高低是米曲霉菌種的衡量指標(biāo)，蛋白酶活性的高低決定著蛋白質(zhì)的利用率，高的酶活力不僅可以更好地分解原料，提高原料利用率，而且還可以減少釀造工業(yè)的污染，對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)具有十分重要的作用[14]。本文采用滬釀3.042米曲霉為菌種對(duì)核桃粕進(jìn)行發(fā)酵，以蛋白酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)確定米曲霉發(fā)酵核桃粕產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，為核桃粕蛋白資源的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕：河北綠嶺有限公司生產(chǎn)基地；滬釀3.042米曲霉：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；福林試劑、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅指示劑、石油醚、硫酸銅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、干酪素、酪氨酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-100馬弗爐：鶴壁億欣儀表有限公司；UV-1700PC紫外可見分光光度計(jì)：上海美析儀器分析公司；WS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海樹立儀器儀表公司；MB35水分測(cè)定儀：瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米曲霉發(fā)酵核桃粕工藝流程

以冷榨核桃粕為原料，進(jìn)行粉碎和過篩，并將篩下物做浸潤(rùn)處理。潤(rùn)料完成后，將核桃粕放入鍋中蒸煮1 h后燜鍋冷卻。待物料溫度降到32℃后，接入一定量的米曲霉菌種，混合均勻后平鋪到托盤中，料厚1.0 cm～1.5 cm，并在物料上蓋6層濕紗布，每隔2 h向濕布上噴灑無菌水保持紗布的濕潤(rùn)狀態(tài)，以保證米曲霉生長(zhǎng)所需的濕度。最終將物料放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。由于菌種在生長(zhǎng)繁殖的過程中會(huì)產(chǎn)熱，在培養(yǎng)的過程中，物料的溫度往往會(huì)高于培養(yǎng)箱的溫度，所以需要在物料中插入溫度計(jì)，以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)物料溫度。

1.3.2 核桃粕基本成分的測(cè)定

用紅外線快速水分測(cè)定儀來測(cè)定水分含量；灰分參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；脂肪含量參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；蛋白含量參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；根據(jù)減差法計(jì)算出碳水化合物含量，即總碳水化合物含量等于100%減去樣品的水分含量、脂肪含量、灰分含量以及蛋白質(zhì)含量的總和。

1.3.3 核桃粕中蛋白酶活力的測(cè)定

1.3.3.1 蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)酪氨酸不同濃度所對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0100x-0.003 4，R2=0.99，線性關(guān)系良好。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

1.3.3.2 蛋白酶活力的計(jì)算

根據(jù)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》中的福林法并稍作修改，進(jìn)行蛋白酶活性的測(cè)定與計(jì)算。

式中：X為樣品蛋白酶活力，U/g；A為樣品在波長(zhǎng)為660nm時(shí)測(cè)得的吸光度值；N為樣品稀釋倍數(shù)（稀釋10倍）；k為標(biāo)曲的斜率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 浸潤(rùn)水量的選擇

稱取核桃粕100 g，分別用物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)的40%、50%、60%的水量去潤(rùn)料30 min，浸潤(rùn)完成后將核桃粕在2 200 W的功率下蒸煮1 h，測(cè)定熟料的水分含量。

1.3.4.2 發(fā)酵溫度對(duì)米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，接入0.025%的米曲霉菌種，分別于28、31、34、37℃的溫度下恒溫發(fā)酵48 h后，測(cè)定蛋白酶活力，每個(gè)樣品做3次平行。

1.3.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，接入0.025%的米曲霉菌種，在31℃的條件下恒溫發(fā)酵 24、34、44、48、52 h后，測(cè)定蛋白酶活力，每個(gè)樣品做3次平行。

1.3.4.4 米曲霉添加量對(duì)核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，分別接入0.005%、0.010%、0.015%、0.025%、0.035%的米曲霉菌種，在31℃的條件下恒溫發(fā)酵48 h后，測(cè)定蛋白酶活力，每個(gè)樣品做3次平行。

1.3.4.5 通風(fēng)量對(duì)米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

稱取2份100 g的核桃粕，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后接入0.015%的米曲霉菌種，在31℃的條件下恒溫培養(yǎng)，其中一份核桃粕在培養(yǎng)過程中通風(fēng)處理，48 h后測(cè)定其蛋白酶活力。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳產(chǎn)酶條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分析各因素的適宜水平，選擇發(fā)酵溫度、米曲霉添加量、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化米曲霉在核桃粕中發(fā)酵的最佳產(chǎn)酶條件。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Level of orthogonal test

1.3.6 米曲霉在核桃粕與豆粕中蛋白酶活力的比較

稱取核桃粕與豆粕各100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷卻后，按照正交試驗(yàn)得出的最佳產(chǎn)酶條件，對(duì)兩種物料各自進(jìn)行發(fā)酵處理，測(cè)定其蛋白酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 22.0、Excel 2010軟件；做圖用Origin8.6。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃粕基本成分分析

利用1.3.2方法對(duì)核桃粕的主要成分進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 核桃粕基本成分分析Table 2 Analysis of basic components of walnut meal

由表2可知，核桃粕中的蛋白含量高達(dá)51.36%，如果將這部分蛋白合理高效地利用起來，對(duì)提高核桃附加價(jià)值，促進(jìn)企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益將具有重大意義。核桃粕脂肪25.94%，碳水化合物11.51%，不僅滿足了米曲霉所需的氮源和碳源，而且部分脂肪的氧化為最終產(chǎn)品提供了部分風(fēng)味物質(zhì)。

2.2 浸潤(rùn)水量的選擇

浸潤(rùn)水量與熟料水分對(duì)比見表3。

表3 浸潤(rùn)水量與熟料水分對(duì)比Table 3 Comparison of infiltration water and clinker water

如表3所示，對(duì)核桃粕進(jìn)行不同浸潤(rùn)水量的處理并蒸煮后，所對(duì)應(yīng)的熟料中水分含量相差不大。冷榨核桃蛋白具有良好的吸水性[15]，其通過與水的相互作用而具有結(jié)合水的能力，蛋白質(zhì)的帶電基團(tuán)、親水基團(tuán)和非極性基團(tuán)都可以與水分子緊密結(jié)合[16]。在蒸料的過程中，由于高溫及水蒸氣的作用，使得核桃蛋白發(fā)生變性并形成凝膠，吸水性增強(qiáng)[17]。同時(shí)也會(huì)使經(jīng)過不同浸潤(rùn)水量處理的物料在蒸煮后，達(dá)到基本相近的水分含量。水分對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響主要體現(xiàn)在對(duì)米曲霉?fàn)I養(yǎng)傳輸途徑的保證上，熟料水分保持在40%～50%最為恰當(dāng)。物料水量過高則會(huì)導(dǎo)致其氧氣含量降低，過低則營(yíng)養(yǎng)傳遞的界面喪失，這樣都會(huì)使米曲霉的蛋白分泌受到影響[18]。所以本試驗(yàn)采取60%的浸水量進(jìn)行操作。同時(shí)由于滬釀3.024的遺傳特性決定了其分泌中性和堿性蛋白酶的能力遠(yuǎn)比分泌酸性蛋白酶能力強(qiáng)，因此在培養(yǎng)的過程中還是以中性pH值為好（pH=7左右）[19]。因此本試驗(yàn)采用中性自然的無菌水進(jìn)行浸潤(rùn)。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

發(fā)酵溫度對(duì)米曲霉酶活力的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)米曲霉酶活力的影響Fig.2 Effect of ferment temperature on enzyme activity of soy sauce koji

在不同發(fā)酵溫度下，米曲霉在核桃粕中的所產(chǎn)生的蛋白酶活力不同。米曲霉屬于中溫菌，在30℃左右的環(huán)境下菌落生長(zhǎng)最好，過高或過低的溫度均會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用[20]。由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，米曲霉分泌酶的能力不斷增強(qiáng)，使核桃粕中的蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為31℃時(shí)，核桃粕中的蛋白酶活力（1 254.67 U/g）達(dá)到了峰值，說明此時(shí)的溫度最適合米曲霉在核桃粕中分泌蛋白酶。當(dāng)發(fā)酵溫度超過31℃后，米曲霉的活動(dòng)受到了溫度的限制，生成的蛋白酶量開始減少，蛋白酶活力也在大幅度降低[21]。所以初步確定，米曲霉產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵溫度為31℃。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)米曲霉蛋白酶活力的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)米曲霉酶活力的影響Fig.3 Effect of ferment time on enzyme activity of soy sauce koji

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，米曲霉利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷地生長(zhǎng)繁殖，使核桃粕中的蛋白酶活力積累增加，并在48 h時(shí)達(dá)到最大值，酶活力為1 254.67 U/g[22]。超過48 h之后，米曲霉分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸、多肽等胞外蛋白質(zhì)開始大量積累，蛋白酶活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)[23]。此時(shí)核桃粕中的淀粉酶活性也較高。而淀粉的水解產(chǎn)物葡萄糖等對(duì)霉菌產(chǎn)蛋白酶的阻礙作用也會(huì)導(dǎo)致蛋白酶活力先增加后減小[24]。所以在核桃粕中，米曲霉產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.5 米曲霉添加量對(duì)核桃粕中蛋白酶活力的影響

米曲霉添加量對(duì)其蛋白酶活力的影響見圖4。

圖4 米曲霉添加量對(duì)米曲霉酶活力的影響Fig.4 Effect of Aspergillus oryzae addition on enzyme activity of soy sauce koji

由圖4可知，隨著米曲霉添加量的增加，核桃粕中的蛋白酶活力先升高后降低，當(dāng)米曲霉添加量為0.015%時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到最大值（1 340.00 U/g），說明此時(shí)米曲霉的數(shù)量與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)恰好達(dá)到平衡，產(chǎn)生的蛋白酶最多。當(dāng)米曲霉添加量大于0.015%時(shí)，蛋白酶活力開始下降。從理論上講，添加量過大可使出發(fā)菌體的數(shù)量增加，但也會(huì)加大原料中可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，使個(gè)體菌體的生長(zhǎng)狀況不佳，影響孢子的成熟，最終影響蛋白酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生[18]。所以確定，當(dāng)米曲霉添加量為0.015%時(shí)，核桃粕中的蛋白酶活力最高。

2.6 通風(fēng)量對(duì)米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影響

按照1.3.4.5的方法，對(duì)兩種發(fā)酵核桃粕進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在其他因素相同的條件下，經(jīng)過通風(fēng)處理的核桃粕蛋白酶活力為585.00 U/g，而未經(jīng)通風(fēng)處理的核桃粕蛋白酶活為858.00 U/g，其氨基酸態(tài)氮的含量也明顯高于前者。因?yàn)楸敬卧囼?yàn)是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，每次試驗(yàn)所選用的物料較少，并且在發(fā)酵的過程中采用的是薄層培養(yǎng)，使得米曲霉具有充足的氧氣，而通風(fēng)會(huì)過多的帶走物料中的水分與熱量，使物料水分下降加快，從而影響到米曲霉蛋白酶的分泌。

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

為了獲得米曲霉在核桃粕中的最佳產(chǎn)酶條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)選發(fā)酵溫度、米曲霉添加量、發(fā)酵時(shí)間這3個(gè)因素，探究其對(duì)米曲霉在核桃粕中發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的影響，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 L9（34）orthogonal test design and results

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4可知，各因素對(duì)核桃粕中蛋白酶活力的影響程度依次為A＞C＞B，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞米曲霉添加量。最優(yōu)組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度為31℃、米曲霉添加量為0.015%、發(fā)酵時(shí)間為50 h，而此最優(yōu)組合與k值最優(yōu)A2B3C3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)作對(duì)比發(fā)現(xiàn)，A2B2C3所對(duì)應(yīng)的蛋白酶活力為1 187.20 U/g，而A2B3C3所對(duì)應(yīng)的蛋白酶活力為867.00 U/g。因此，選擇A2B3C3作為最佳產(chǎn)酶條件。

由表5可知，在所設(shè)計(jì)的因素范圍內(nèi)，A、B、C的P值均小于0.01，說明發(fā)酵溫度、米曲霉添加量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)核桃粕中蛋白酶活力的大小均有極顯著影響。

2.8 米曲霉在核桃粕與豆粕中蛋白酶活力的比較

豆粕也是一種重要的植物性蛋白原料，其蛋白質(zhì)含量一般為30%～50%，富含氨基酸且必需氨基酸平衡性好[25]。近年來大豆粕在加工利用及其實(shí)際應(yīng)用方面都取得了很大的進(jìn)展，所以本文按照正交試驗(yàn)中的最佳產(chǎn)酶條件，對(duì)核桃粕和豆粕進(jìn)行發(fā)酵處理后，對(duì)其中所含的蛋白酶活力進(jìn)行比較。圖5為核桃粕發(fā)酵后物料外觀，圖6為豆粕發(fā)酵后物料外觀。

圖5 28 h和50 h不同時(shí)間段核桃粕發(fā)酵外觀圖Fig.5 Appearance diagram of walnut meal fermentation at different time periods of 28 h and 50 h

圖6 28 h和50 h不同時(shí)間段豆粕發(fā)酵外觀圖Fig.6 Appearance diagram of soybean meal fermentation at different time periods of 28 h and 50 h

從圖5中可以看出，米曲霉在核桃粕中長(zhǎng)勢(shì)良好，在發(fā)酵前期，米曲霉以生長(zhǎng)白色菌絲為主，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，米曲霉孢子大量繁殖，呈現(xiàn)為明顯的黃綠色微小顆粒。最終測(cè)得核桃粕中的蛋白酶活力為1 225.40 U/g，豆粕中的蛋白酶活力為434.80 U/g，核桃粕中的蛋白酶活力要明顯高于豆粕中的蛋白酶活力。以此說明，與豆粕相比，米曲霉更適宜在核桃粕發(fā)酵。

3 結(jié)論

核桃粕是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白的重要來源，但目前卻被用作生產(chǎn)價(jià)值低廉且不可食用的飼料和肥料，造成了蛋白資源的極大浪費(fèi)。所以對(duì)核桃粕進(jìn)行酶解發(fā)酵，對(duì)促進(jìn)核桃資源的高效利用具有重大意義。本文通過單因素和正交試驗(yàn)確定了米曲霉在核桃粕中發(fā)酵的最佳產(chǎn)酶條件：發(fā)酵溫度為31℃，米曲霉添加量為0.015%，發(fā)酵時(shí)間為50 h，這3個(gè)因素對(duì)核桃粕中蛋白酶活力的大小均有極顯著影響。在此最佳條件下培養(yǎng)，菌種表現(xiàn)出的蛋白酶活力為1 187.20 U/g。并且在最優(yōu)條件下，對(duì)核桃粕和豆粕進(jìn)行發(fā)酵處理，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，米曲霉在核桃粕中的蛋白酶活力要明顯高于豆粕中的蛋白酶活力。