核桃青皮甲醇提取物的抗氧化活性研究

劉猛，吳偉源，章檢明，王小佳

（1.呂梁學院生命科學系，山西 呂梁 033000；2.山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西 呂梁 033000；3.浙江省農業科學院食品科學研究所，浙江 杭州 310016）

核桃青皮，來源于核桃成熟后剝落的一層厚厚的綠色外皮，屬于核桃的加工副產物。其油脂中含有大量不飽和脂肪酸[1]，含有很多對身體有益的油酸和亞油酸[2-3]。有研究指出核桃青皮在食品、醫藥、農藥、色素方面具有重要的使用價值[4]，利用核桃青皮中的活性成分，對研發天然的植物性抗氧化劑具有重要的作用[5]。多酚類物質是天然的抗氧化成分，在一定條件下，其抗氧化能力隨著多酚含量的增加而提高[6]。本試驗使用甲醇對核桃青皮進行提取，利用不同體積分數的甲醇溶液，獲得核桃青皮內的活性成分，并對提取液進行體外抗氧化實驗，闡明其抗氧化活性差異，更好地發揮核桃青皮的研究價值和經濟價值。

相關研究指出，核桃青皮富含多酚類、萘醌苷類和色素類化合物等功能成分[7-8]。田平平等[9]通過已醇提取核桃青皮，得到了槲皮素-3-O-葡萄糖苷、鞣花和表兒茶素等7種抗氧化活性的主要成分。張衛星等[10]發現用乙酸乙酯和氯仿溶液對核桃青皮進行提取，二者的提取液對DPPH自由基清除能力及還原力很強，表現出與多酚物質或功能組分含量有一定的正相關關系。呂建平等[11]發現當料液比為1∶18（g/mL）時，活性物質中多糖提取率為9.02%，其對羥基自由基清除率低于維生素C，同樣，對超氧陰離子自由基清除率也沒有維生素C效果好，但均具有一定的清除效果。在核桃青皮的化學成分研究中，甙類物質可以減輕癥狀、緩解疼痛、提高食欲、助于睡眠，丹寧類物質可用于工業做染色劑和固色劑[4]。醇提取是一種常見的預處理方式，甲醇的分子極性比乙醇分子極性大，所以核桃青皮經甲醇溶液提取后研究其抗氧化活性，為研發天然的抗氧化劑提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃（含青皮，食品級）：市售；硫酸亞鐵、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、福林酚、無水乙醇、無水甲醇、鐵氰化鉀、三（羥甲基）氨基甲烷、三氯化鐵、三氯乙酸、無水碳酸鈉（均為分析純）：福晨（天津）化學試劑有限公司；沒食子酸（分析純）：大茂（天津）化學試劑有限公司；鄰苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（均為分析純）：飛凈（福州）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-98-II恒溫水浴鍋：泰斯特（天津）儀器有限公司；AC 100-240 V磁力攪拌器、MC-4 K型低速離心機：群安（寧波）試驗儀器有限公司；FA 214型電子天平（千分之一）：豪晟（上海）科學儀器有限公司；DSA 100-GL 2-4.0 L超聲波清洗儀：德森精工有限公司；EPOCH 2酶標儀：伯騰（美國）儀器有限公司；PHS-3 CU pH計：越平（上海）儀器有限公司；101型電熱鼓風干燥箱：科偉永興（北京）儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃青皮提取物的制備

取適量自然晾干的核桃青皮，50℃烘干至恒重后粉碎、過80目篩后，避光保存，備用。稱取1 g核桃青皮粉，按料液比1∶10（g/mL）分別加入 0%、20%、40%、60%、80%甲醇，在30℃條件下超聲30 min，靜置12 h，4 000 r/min，離心10 min后取上清液，即得核桃青皮提取液，避光保存[12]。

1.3.2 多酚含量的測定

參考鄭渝川等[13]和張天財等[14]的方法中福林酚比色法測定多酚含量。

1.3.3 核桃青皮提取液抗氧化活性的測定

1.3.3.1 核桃青皮提取液還原力的測定

核桃青皮提取液還原力的測定采用普魯士藍法[15]，稍作修改。取50 μL的不同甲醇濃度提取液，分別加入125 μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液，混勻后，45℃水浴25 min，快速冷卻至室溫25℃，加入125μL 10%三氯乙酸終止反應。4 000r/min離心10min后，取125μL上清液，加入125μL蒸餾水和25μL0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，室溫25℃放置10 min。在700nm處測吸光度，記為A700nm，其吸光度反映了還原力的大小。

1.3.3.2 羥基自由基清除率的測定

參照文獻[16]的方法，稍作修改。取濃度為9.0mmol/L FeSO4溶液50 μL，加入9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液50 μL，再加入不同甲醇濃度提取液 50 μL，最后加入8.8mmol/LH2O2溶液50μL，搖勻后在37℃反應30min，在波長510 nm處測定吸光度A1，按照上述相同方法，使用蒸餾水替代樣品溶液，測定A0，使用蒸餾水替代過氧化氫，測定A2。由公式（1）計算出羥基自由基清除率。

式中：A0為空白溶液吸光度；A1為加入樣品后的吸光度；A2為不加顯色劑的吸光度。

1.3.3.3 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻[12，17-18]的方法，稍作修改。將不同樣品稀釋為1 mg/mL，取50 μL 1 mg/mL不同樣品溶液和50 μL 0.1 mmol/LDPPH溶液，混勻后在室溫25℃下避光靜置30 min，用酶標儀在517 nm處測定吸光度（A）。每個樣品重復測定3次，結果取平均值。由公式（2）計算出DPPH自由基清除率。

式中：A1為加入提取液后DPPH的吸光度；A2為同等量的無水乙醇代替DPPH溶液后的吸光度；A3為DPPH溶液的吸光度。

1.3.3.4 超氧陰離子自由基清除率的測定

參考文獻[19-20]方法稍作修改。依次向試管中加入50 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 值為8.2）225 μL，在25℃的水浴鍋中保溫20 min，加入50 μL樣品溶液，再加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液20 μL，快速混勻，放入25℃的水浴鍋中5 min，立即加入8 mol/L鹽酸溶液50 μL終止反應。在325 nm處測定吸光度A1。用去離子水代替鄰苯三酚，測定A2，用去離子水代替樣品溶液做空白參照，測定A3。由公式（3）計算得出超氧陰離子自由基清除率。

式中：A1為加入鄰苯三酚溶液后的吸光度；A2為加入離子水后的吸光度；A3為空白溶液吸光度。

1.4 數據處理和統計學分析

數據采用Origin9.1軟件進行計算繪圖。采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。數據以平均值±標準差表示，p＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 多酚含量的測定

不同甲醇濃度提取液對多酚含量的影響如圖1所示。

圖1 不同甲醇濃度提取液中多酚含量Fig.1 Polyphenol content in extracts under different methanol concentrations

由圖 1可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇提取液中多酚濃度分別為88.692、95.801、70.866、64.633、46.697 μg/mL，且隨著濃度升高有顯著性差異。當甲醇濃度為0%～20%時，提取液中多酚含量逐漸增加，20%甲醇提取效果最好，多酚含量最高，繼續增加甲醇濃度后，提取液中多酚含量逐漸下降，80%甲醇提取效果最差，多酚含量最低。因此，當采用20%甲醇進行提取時，得到的提取液多酚含量最高。

2.2 不同甲醇濃度提取液對抗氧化活性的影響

2.2.1 不同甲醇濃度提取液對還原力的影響

不同甲醇濃度的提取液的還原力大小如圖2所示。

圖2 不同甲醇濃度提取液的還原力比較Fig.2 Comparison of reducing power of extracts under different methanol concentrations

由圖 2可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇濃度提取液的還原力分別為0.692、0.678、0.524、0.524、0.515。利用不同甲醇濃度溶液對核桃青皮進行提取，隨著甲醇溶劑濃度的增加，提取液的還原力逐漸下降，其中0%與20%的甲醇提取液還原力相比無顯著性差異，40%、60%和80%甲醇提取液的還原力相互之間無顯著性差異。以0%的甲醇提取液還原力最高。

2.2.2 不同甲醇濃度提取液對羥基自由基的清除率的影響

不同甲醇濃度提取液對羥基自由基清除率的影響如圖3所示。

圖3 不同甲醇濃度提取液的羥基自由基清除率比較Fig.3 Comparison of OH free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations

由圖 3可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇濃度提取液的羥基自由基清除率分別為59.09%、61.18%、59.37%、53.93%、41.33%。隨著甲醇溶劑濃度的增加，提取液的羥基自由基清除率先上升后下降。其中0%、20%、40%和60%甲醇提取液的羥基自由基清除率相互之間無顯著性差異，但是與80%甲醇提取液相比均有顯著性差異。以20%甲醇提取液的羥基自由基清除率最高。

2.2.3 不同甲醇濃度提取液對DPPH自由基清除率的影響

不同甲醇濃度的提取液對DPPH自由基清除率的影響如圖4所示。

圖4 不同甲醇濃度提取液的DPPH自由基清除率比較Fig.4 Comparison of DPPH free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations

由圖4可知，不同甲醇濃度提取液的DPPH自由基的清除率分別為72.26%、96.18%、86.01%、87.28%、91.35%。其中0%與20%和80%甲醇提取液的羥基自由基清除率有顯著性差異，但40%與60%甲醇提取液與其他組相比均不具有顯著性差異。20%甲醇提取液對DPPH自由基的清除效果最好；DPPH自由基的清除率最低的是0%甲醇提取液。

2.2.4 不同甲醇濃度提取液對超氧陰離子自由基的清除率的影響

不同甲醇濃度提取液對超氧陰離子自由基清除率的影響如圖5所示。

由圖 5可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇濃度提取液的超氧陰離子自由基清除率分別為43.27%、46.06%、47.39%、46.67%、24.85%。當甲醇濃度為0%～40%時，提取液的超氧陰離子自由基清除率逐漸增加，40%甲醇提取液的清除率最高；繼續增加甲醇濃度后，提取液的超氧陰離子自由基清除率逐漸下降，80%甲醇提取液的清除率最低。其中0%、20%、40%和60%甲醇提取液的羥基自由基清除率相互之間無顯著性差異，但是與80%甲醇提取液相比均有顯著性差異。以40%的甲醇提取液的超氧陰離子自由基清除率最高。

圖5 不同甲醇濃度提取液的超氧陰離子自由基清除率比較Fig.5 Comparison of O2-free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations

3 結論

以核桃青皮為原料，采用不同甲醇濃度進行提取，測定了多酚含量、羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除率、還原力等抗氧化活性指標，最終闡明不同甲醇濃度提取液抗氧化活性間的差異。經研究得出，核桃青皮以20%甲醇為提取劑時多酚濃度最高，而80%甲醇提取劑多酚濃度最低。核桃青皮提取液的羥基自由基清除能力與提取液中的多酚含量相關，以20%甲醇溶液提取效果最好。隨著甲醇溶劑濃度的增加，提取液的還原力逐漸下降，其還原力與提取溶劑濃度成負相關，以0%甲醇提取的還原力最高。而DPPH自由基清除能力和甲醇濃度無線性關系，不同甲醇濃度提取液中以20%甲醇提取對DPPH清除能力最高，不同濃度提取液中40%甲醇提取對超氧陰離子自由基清除能力最高。由此得出結論，20%甲醇提取液抗氧化活性最佳。