核桃青皮提取物對急性高脂血癥小鼠的降脂作用及成分研究

張旭，陸秋，張希，牛若楠，陳朝銀，趙聲蘭*

（1.云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500；2.畢節市第一人民醫院藥劑科，貴州 畢節 551700；3.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

高脂血癥是由本身血脂代謝異常而引起的疾病，常表現為血清高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C） 降低或總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol LDL-C）升高。目前，高脂血癥的治療藥物主要以他汀類、貝特類為主。雖然療效顯著，但是這兩類藥物作用靶點單一，近年來研究發現他汀類藥物可能引發肝損傷、橫紋肌溶解、新發腫瘤和糖尿病等不良反應，而且停藥后反彈率高。因此，植源性藥物的研究成為人們關注的熱點[1]。

核桃青皮又稱青龍衣，為核桃外部的一層厚厚綠色果皮，是核桃的主要副產品之一，每年其產量巨大，都被丟棄在田間地頭，不僅造成資源浪費，還帶來環境污染。有研究報道核桃青皮中含有多種活性物質，如多酚類化合物[2-4]、黃酮類化合物[5]、醌類化合物[6-7]、二芳基庚烷類化合物[8]、萜類化合物以及甾體類化合物、多糖[9-10]等。現代研究核桃青皮具有抗氧化[11-12]、抗菌[13-14]、抗炎[15]、抗腫瘤[16]、保肝[17]、殺蟲[18]、改善腸道菌群[19]、加快傷口愈合[20]等作用。近年來，從天然產物中篩選治療和預防高脂血癥的物質成為國內外研究的熱點[21]。本文利用急性高脂血癥小鼠模型探究核桃青皮乙醇提取物的降脂作用，然后利用液質聯用技術（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）分析核桃青皮提取物中降脂活性成分，以期為核桃青皮資源的有效開發與利用奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

核桃：云南大理漾濞縣深紋核桃，漾泡，9月采收，機械脫外層青皮；核桃青皮粗提取物：云南中醫藥大學藥食資源實驗室自制。基礎飼料：蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司。

無水碳酸鈉（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；福林酚試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；生理鹽水：昆明市宇斯藥業有限責任公司；非諾貝特膠囊：法國利博福尼制藥公司；血清總膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司。

健康昆明種雄鼠[體重18 g～22 g，生產許可證號：SCXK（京）20140004]：中國醫學科學院醫學實驗動物研究所。所有動物實驗的操作均嚴格遵守云南中醫學院動物倫理委員會的相關條例規定。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；UV759S紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SK7210HP超聲波清洗機：上海科導超聲儀器有限公司；ZDHW調溫電熱套：北京中興偉業儀器有限公司；YRE-2020Z旋轉蒸發器：鞏義市予華儀器有限責任公司；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；INFINITEM200PRO酶標儀：瑞士TECAN公司；TM（OHAUS）先行者電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；H.H.S電熱恒溫水浴鍋：上海醫療器械五廠。

2 方法

2.1 核桃青皮提取物的制備

新鮮核桃青皮采用電熱鼓風干燥箱烘干，粉碎過60目篩。過篩后的核桃青皮粉末采用以下提取工藝進行提取：50%乙醇、料液比 1∶20（g/mL），提取溫度70 ℃、提取3次，每次提取時間為1 h。合并3次提取液并過濾、濾液濃縮、冷凍干燥，備用。

2.2 核桃青皮提取物中多酚含量的測定

2.2.1 溶液的配制

福林酚溶液的配制：精確移取2.5 mL濃度為100%的福林酚溶液于25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容后即得濃度為10%的福林酚溶液。

Na2CO3溶液的配制：稱取1.875 g Na2CO3固體加蒸餾水溶解并定容至25 mL，即得7.5% Na2CO3溶液。

樣品溶液的制備：精確稱取25 mg核桃青皮粗提物粉末于100 mL容量瓶中，加60%乙醇超聲溶解并定容。

2.2.2 核桃青皮提取物多酚含量的測定

取1 mL 2.2.1中制備的樣品溶液置于10 mL容量瓶中，加5.0 mL 10%福林酚溶液，充分搖勻，反應5 min后，再加入4mL7.5% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，30℃下避光反應1 h，在765 nm波長下測定吸光度。根據標準曲線方程A=0.094 6c+0.043 9；R2=0.999 1計算得核桃青皮提取物中多酚含量為0.143 8 mg/g。

2.3 急性高脂血癥小鼠模型的建立

84只體重18 g～22 g健康昆明種雄鼠，適應性飼養1周后，根據體重隨機分為6組（每組14只）：正常組、模型組、非諾貝特組[40 mg/（kg·d）]、核桃青皮提取物高劑量組[600 mg/（kg·d）]、核桃青皮提取物中劑量[400 mg/（kg·d）]、核桃青皮提取物低劑量組[200 mg/（kg·d）]，劑量設定以核桃青皮提取物中的多酚量計。正常組和模型組灌胃給予給藥組等量的生理鹽水，其余各組連續灌胃給藥7 d。第7天給藥2 h后，模型組和給藥組腹腔注射蛋黃乳0.5 mL/只（75%蛋黃乳劑：45 mL蛋黃+15 mL生理鹽水，混勻成乳狀，4℃貯藏備用[22]）；正常組注射生理鹽水0.5 mL/只，建立急性高脂血癥小鼠模型。各組小鼠的給藥劑量及給藥濃度見表1。

表1 各組小鼠的給藥劑量及給藥濃度Table 1 The administration dosage and concentration of each group

2.4 小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的測定

于第7天給藥2 h后，正常組腹腔注射生理鹽水（0.5 mL/只），其余各組都進行腹腔注射蛋黃乳0.5 mL/只，禁食不禁水16 h后采用摘除眼球取血法取血，待血樣凝集后，3 000 r/min，4℃離心15 min，取上層血清按各測定試劑盒的操作說明書測定血清TC、TG、LDLC和HDL-C。

2.5 臟器指數的檢測

小鼠稱取體質量后，處死后取肝、腎、脾臟器，稱重并記錄，按下列公式計算臟器指數。

肝指數/%=肝重（g）/體重（g）×100

腎指數/%=腎重（g）/體重（g）×100

脾指數/%=脾重（g）/體重（g）×100

2.6 核桃青皮多酚的LC-MS鑒定

本試驗中采用LC-MS鑒定核桃青皮粗提取物的多酚組成及相對含量，測定條件為安捷倫1260系列高效液相系統，包括G1214AUV探測器和Atlantis T3 C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）反相色譜柱。流動相A和B分別為水溶液（0.1%甲酸）和乙腈溶液，洗脫條件：0～1 min 100%A；1 min～4 min，100%～92%A；4 min～24 min，92%～80%A；24min～26min，80%～70%A；26min～28min，70%～0%A；28 min～35min，100%B；重平衡5 min。流速為350 μL/min、進樣量為10 μL、柱溫度保持在 25 ℃。紫外吸收光譜通過二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）在280 nm處檢測，液相系統被偶聯到microTOF-QII，配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI），電噴霧在負離子模式操作，源電壓3.5 kV。

2.7 數據分析

試驗數據以（均值±標準差）表示，采用GraphPad Prism 5.0統計軟件處理，采用單因素方差進行處理，采用Dunnett-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為具有顯著性意義。

3 結果與分析

3.1 核桃青皮提取物對小鼠臟器指數的影響

小鼠處死后分別摘取肝臟、腎臟、脾臟進行臟器指數的計算，核桃青皮提取物對小鼠臟器指數的影響結果見表2。

表2 核桃青皮提取物對小鼠臟器指數的影響Table 2 Effect of extracts from walnut green husk on organ iedex of mice

由表2可知，比較模型組與正常組，給藥組與模型組之間的差異。結果顯示，與正常組相比較，模型組和核桃青皮提取物高、中、低劑量組小鼠的肝、腎、脾指數差異不顯著（P＞0.05），表明核桃青皮提取物對小鼠臟器無損傷；與正常組相比，非諾貝特組肝指數升高，且差異極顯著（P＜0.01）；與模型組相比，非諾貝特組肝指數和腎指數均升高，且差異顯著（P＜0.05），說明非諾貝特對小鼠的臟器有一定損傷作用。

3.2 核桃青皮提取物對小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響

核桃青皮提取物對小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響見圖1。

圖1 核桃青皮對高脂血癥小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響Fig.1 Effects of walnut green husk extract on serum TC，TG，HDL-C and LDL-C of hyperlipidemia mice

由圖1可知，與正常組相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平均升高，且差異極顯著（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，非諾貝特組和核桃青皮提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組的TC、TG、LDL-C水平降低，除核桃青皮提取物低劑量組的甘油三酯水平降低差異顯著外（P＜0.05），其余劑量組差異均極顯著（P＜0.01）；HDL-C水平升高，且差異極顯著（P＜0.01）。

核桃青皮提取物對高脂血癥小鼠血脂的影響程度見圖2。

圖2 核桃青皮提取物對高脂血癥小鼠血脂水平的影響Fig.2 Effect of walnut green husk extract on serum lipid level in hyperlipidemia mice

由圖2可知，以模型組為基數，非諾貝特組的TC、TG、LDL-C分別降低43.82%、64.62%、45.95%，核桃青皮提取物高劑量組的TC、TG、LDL-C分別降低33.55%、50.82%和51.40%，核桃青皮提取物中劑量組的TC、TG、LDL-C 分別降低 31.21%、43.74%和50.00%，核桃青皮提取物低劑量組的TC、TG、LDL-C分別降低31.34%、29.92%和35.05%。

綜上所述，核桃青皮提取物可顯著地改善急性高脂血癥小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，顯示出良好的降脂作用。

3.3 核桃青皮多酚的LC-MS鑒定結果

采用LC-MS鑒定核桃青皮提取物中的降脂成分。色譜圖分離并標記出16種物質，液相色譜見圖3。

圖3 核桃青皮多酚的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatography of walnut peel polyphenols

通過高效液相-質譜分析，鑒別出16種物質，各個化合物的保留時間，相應的分子式，分子量和所占百分比見表3。

表3 核桃青皮多酚的LC-MS鑒定Table 3 Phenolic compounds identified by LC-MS in walnut green husk

根據高效液相-質譜數據分析，從核桃青皮提取物中分離并鑒別出16種物質，分別為單沒食子酰基葡萄糖、沒食子酸、新綠原酸、3-肉桂酰奎尼酸、特里馬素Ⅰ異構體、特里馬素Ⅰ異構體、3-沒食子酰基葡萄糖苷、兒茶素、焦性沒食子酸、香草酸、2-HHDP-葡萄糖異構體、2-HHDP-葡萄糖異構體、香豆酸己糖苷異構體、咖啡酸、鞣花酸、flavogallonic。

4 結論

血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇是反應機體脂質代謝的主要指標。急性高脂血癥是因為攝入過多外源性膽固醇而導致。小鼠腹腔注射蛋黃乳劑能快速升高TC、TG、LDL-C而形成高膽固醇血癥，且具有經濟、迅速、簡便等優點，可作為篩選降脂藥物的初步方法。本文用急性高脂血癥小鼠模型研究核桃青皮的降脂作用，研究結果表明，核桃青皮提取物能降低急性高血脂小鼠血清中的TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，其降脂機制可能與抑制外源性膽固醇吸收，增加脂質代謝轉運有關。研究結果還顯示非諾貝特能使小鼠肝臟質量增加，非諾貝特在表現出降血脂作用的同時，還對小鼠肝臟有一定的損傷。此外通過高效液相-質譜分析，發現16種多酚類物質，分別為兒茶素、焦性沒食子酸、沒食子酸、單沒食子酰基葡萄糖、香草酸、2-HHDP-葡萄糖異構體、新綠原酸、3-肉桂酰奎尼酸、特里馬素Ⅰ異構體、香豆酸己糖苷異構體、咖啡酸、3-沒食子酰基葡萄糖苷、鞣花酸、flavogallonic，其中單沒食子酰基葡萄糖百分比最高，達20.17%，其次為沒食子酸、3-肉桂酰奎尼酸，分別為8.43%和7.61%。綜上所述，作為傳統中藥之一的核桃青皮（青龍衣）具有良好的降脂活性，其降脂成分可能是多酚類物質。