沒食子酸酯對核桃油及其乳液的抗氧化作用

裴雪晨，陰法文，鐘 旭，劉惠麟，宋 亮，趙冠華，王永富，周大勇*

（1.大連工業大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116034；2.青島海智源生命科技有限公司，山東 青島 266200）

核桃（Juglans regia L.）因油脂含量高（質量分數40%~70%）而被認為是一種有價值的油料作物[1]。核桃油不僅富含油酸和亞油酸，還含有生育酚、脂溶性維生素和植物甾醇等營養功能因子，具有降低心臟病風險、保護心血管健康以及抗癌等活性[2]。核桃油既可用于直接烹飪，也可加工成水包油乳液產品，如牛奶、沙拉醬和醬汁。

核桃油中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）含量高（質量分數約70%），易被氧化。此外，在水包核桃油乳液中，因脂質與水中的促氧化劑之間的接觸面積更大，脂質氧化更快[3]。近年來，抗氧化劑被廣泛應用于提高富含PUFAs的植物油及其水包油乳液的穩定性。其中，多酚類抗氧化劑因出色的抗氧化能力、安全性以及抗癌、抗炎和保護血管等多種活性而被廣泛應用[4-5]。研究人員已經使用多酚來延緩核桃油的氧化。例如Martínez等報道了迷迭香提取物可以延緩核桃油的氧化[4]。施琳等發現苦杏殼木醋液多酚在核桃油中表現出良好的抗氧化活性[5]。

酚酯是一種多酚衍生物，通過酯鍵將脂肪酸與酚結合而得，與游離多酚相比，具有更強的疏水性。因此，酚酯比游離多酚更容易與脂肪和油脂基體結合，并能更有效地發揮抗氧化能力[6]。近年來，游離多酚及其酚酯在散裝油和水包油乳液中的抗氧化性能得到了廣泛研究。在油脂中，游離多酚及其酚酯的抗氧化性能并不完全依賴于疏水性，極性的游離多酚抗氧化效果甚至強于疏水性強的酚酯[7]。然而在乳液中，人們發現其抗氧化性能與鏈長之間呈現拋物線關系，特定疏水性閾值范圍內的酚酯具有優異的抗氧化性能，這種現象被稱為“截斷效應”[8]。然而，游離多酚及其酚酯在核桃油及其水包油乳液中的抗氧化性能尚未得到研究。

作者研究了沒食子酸（gallic acid，GA）及其烷基酯（沒食子酸乙酯（GA-C2）、沒食子酸丁酯（GAC4）、沒食子酸辛酯（GA-C8）、沒食子酸月桂酯（GA-C12）、沒食子酸十六烷基酯（GA-C16）、沒食子酸十八烷基酯（GA-C18））在核桃油和水包核桃油乳液中的抗氧化性能。此外，還采用1，1-二苯基-2-苦肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazl，DPPH）和2，2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基清除能力表征了GA及其烷基酯的抗氧化能力。研究結果為選擇適用于核桃油及其水包油乳液的抗氧化劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精制核桃油（不含抗氧化劑）：青島海智源生命科技有限公司提供。抗氧化劑GA、GA-C2、GA-C4、GA-C8、GA-C12、GA-C16和GA-C18：北京寶希迪有限公司產品。所有分析純試劑均為天津科密歐化學試劑有限公司產品。

1.2 儀器與設備

AB204-N型電子分析天平：梅特勒-托利多有限公司產品；電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司產品；XW-80A漩渦振蕩器：上海精科實業有限公司產品；Infinite M200多功能酶標儀：美國Tican公司產品；UV-5500紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產品；T25數顯勻漿機：德國IKA公司產品；倒置顯微鏡：日本尼康公司產品。

1.3 研究方法

1.3.1 油和乳液樣品的制備樣品中抗氧化劑的添加量見表1。對于含有GA及其烷基酯的油樣，添加量為0.47 mmol/kg（中國標準GB 2760—2014[9]所允許的沒食子酸丙酯的最大添加量）。以上述核桃油樣品為原料，制備了以吐溫20為乳化劑的油與水體積比為6∶4的水包核桃油乳液。首先，將2 g吐溫20溶于48 g去離子水。然后，將油樣（12 g）與乳化劑溶液（8 g）混合，用高速勻漿機勻漿5 min制得乳液。采用倒置顯微鏡觀察新制備乳液的明場顯微圖。

表1 不同樣品中抗氧化劑的添加量Table 1 Addition of adding antioxidants in different samples

1.3.2 脂質氧化程度測定將上述油和乳液樣品置于避光容器中，貯藏在60℃的烘箱中，在規定的時間取樣測定。

1）POV的測定 參考Wagner等的方法[10]。將乳液樣品（0.167 g）或油樣品（0.1 g）分別溶解在1.5 mL異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）和1.5 mL異辛烷中。取乳液的上層有機相或油的稀釋液（50μL）溶解在1.45 mL甲醇與正丁醇的混合溶液（體積比2∶1）中，與10μL二價鐵離子溶液（通過將0.806 g氯化鋇、1 g硫酸亞鐵、1 mL 10 mol/L鹽酸溶解在25 mL去離子水制得）和10μL 3.94 mol/L硫氰酸銨溶液在避光條件下反應20 min，測定510 nm處的吸光度。根據過氧化氫異丙苯標準曲線計算樣品的POV。

2）共軛二烯值（CD）的測定 參考中國標準GB/T 22500—2008的方法[11]并適當修改。將0.016 7 g乳液樣品用異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）稀釋至10 mL，以233 nm處測定的吸光度表示，以異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）為空白，并計算CD。

式中：Aλ為樣品溶液在波長λ處的吸光度；C為樣品溶液的質量濃度，g/dL。

3）硫代巴比妥酸（TBA）值的測定 參考John等的方法測定[12]。將乳液樣品（0.167 g）或油樣（0.1 g）溶于1 mL氯仿與乙醇的混合溶液（體積比1∶1）中，然后加入2.5 mL TBA試劑。沸水浴10 min后冷卻，在2 500 r/min的條件下離心10 min，在532 nm處測定反應混合物的吸光度。根據丙二醛標準曲線計算TBA值。

4）茴香胺值（p-AV）的測定 基于中國標準GB/T 24304—2009的方法[13]，并稍微修改。將乳液樣品（1.25 g）用異辛烷與異丙醇的混合溶液（體積比3∶1）稀釋至25 mL，在350 nm處測定吸光度。將上述混合物（5 mL）與1 mL質量分數0.25%的p-茴香胺試劑（通過將0.25 g的p-茴香胺溶解于100 mL冰乙酸中制得）反應10 min后，再次在350 nm處測定吸光度，并計算p-AV值。

式中：Q為測定溶液中的樣品質量濃度，1 g/dL；V為溶解試樣的體積，25 mL；A2為與p-茴香胺試劑反應后樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；m為樣品的質量，g。

1.3.3 自由基清除能力測定

1）DPPH自由基清除能力的測定 根據Xu等的方法對GA及其烷基酯的DPPH自由基清除能力進行評估[14]。將2 mL GA及其烷基酯的乙醇溶液（0.047 mmol/L）與2 mL DPPH乙醇溶液（0.3 mmol/L）渦旋1 min，然后避光貯存30 min，于517 nm處測定吸光度，并計算DPPH自由基清除能力。

式中：As為樣品反應液在517 nm處的吸光度；Ac為乙醇溶液在517 nm處的吸光度。

2）ABTS自由基清除能力的測定 采用Re等的方法并稍微改進，以評價GA及其烷基酯的ABTS自由基清除能力[15]。制備好ABTS溶液后用乙醇稀釋，至其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。將0.8 mL GA及其烷基酯的乙醇溶液（0.047 mmol/L）與0.2 mL ABTS-乙醇試劑渦旋1 min，然后避光貯存6 min，于734 nm處測定吸光度，并計算ABTS自由基清除能力。

式中：As為樣品反應液在734 nm處的吸光度；Ac為乙醇溶液在734 nm處的吸光度。

1.3.4 數據分析采用SPSS 19.0軟件、Origin 2018和Excel 2010進行數據分析。所得數據以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析（Student-Newman-Keuls test）對平均值進行比較和顯著性檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 水包核桃油乳液的表征

新制備的含有GA及其烷基酯的水包核桃油乳液的外觀和微觀圖片見圖1和圖2。所有新鮮乳液呈白色，分散均勻。這些乳液的油滴呈圓形，表面光滑，彼此之間沒有交聯。此外，所制備的乳液在60℃加速貯存5 d仍保持物理穩定性。可見，所制備的水包油乳液是成功的且抗氧化劑對乳液的微觀形貌影響不大。

圖1 新制備的水包核桃油乳液的外觀照片Fig.1 Macroscopic pictures of the freshly prepared walnut oil-in-water emulsions

圖2 新制備的水包核桃油乳液的明場微觀顯微圖Fig.2 Brightfield microscopy micrographs of the freshly prepared walnut oil-in-water emulsions

2.2 沒食子酸烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能

POV和CD分別是反映脂質過氧化物和共軛二烯等初級氧化產物生成的指標。如圖3（a）和圖3（b）所示，60℃加速貯藏時，兩項指標均隨貯藏時間延長逐漸增加，表明水包油乳液中持續生成初級氧化產物。與未添加抗氧化劑的水包油乳液相比，添加GA及其烷基酯的水包油乳液的POV和CD水平顯著降低（P<0.05），表明GA及其烷基酯具有良好的抗氧化性能。此外，烷基鏈長影響沒食子酸烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能，其中GA-C2的抗氧化活性最強（P<0.05）。

采用TBA和p-AV來監測丙二醛、2，4-二烯醛和2-烯烴醛等次級氧化產物的形成。如圖3（c）和圖3（d）所示，60℃加速貯藏過程中，兩項指標均隨貯藏時間延長不斷增加，說明初級氧化產物不斷分解為次級氧化產物。添加GA及其烷基酯的水包油乳液的TBA和p-AV水平均顯著低于未添加抗氧化劑的水包油乳液（P<0.05），再次彰顯了其良好的抗氧化性能。實驗結果同樣顯示GA-C2具有最強的抗氧化活性（P<0.05）。

加速貯藏實驗表明，GA及其烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能隨鏈長增加出現先增加后降低的趨勢，呈現“截斷效應”。此前也有研究報道游離多酚及其酚酯在水包油乳液體系中存在“截斷效應”。例如，Elder等觀察到烷基間苯二酚及其烷基酯在水包藻類油乳液中的抗氧化性能呈上升又下降趨勢，當烷基鏈長為20時表現出最佳的抗氧化性能[16]。Almeida等發現，在水包橄欖油乳液中，羥基酪醇及其脂肪酸酯的抗氧化性能隨鏈長增加先升高后降低，羥基酪醇辛酯具有最優的抗氧化性能[17]。

2.3 沒食子酸烷基酯在核桃油和均相溶液中的抗氧化性能

選擇POV和TBA分別監測核桃油中初級氧化產物和次級氧化產物的生成。如圖4（a）和圖4（b）所示，在貯藏相同時間后，添加GA及其烷基酯的核桃油POV和TBA水平均顯著低于未添加抗氧化劑的核桃油（P<0.05），表明GA及其烷基酯具有較好的抗氧化活性。此外，烷基鏈長對GA及其烷基酯在核桃油中的抗氧化性能影響不大，但整體的抗氧化性能隨鏈長的增加而下降（P>0.05）。Laguerre等也發現，烷基鏈長對綠原酸及其烷基酯在玉米油中的抗氧化性能影響不顯著[18]。

圖3 沒食子酸及其烷基酯在水包核桃油乳液中的抗氧化性能Fig.3 Antioxidant performances of GA and its alkyl esters in walnut oil-in-water emulsions

GA及其烷基酯在乙醇溶液中的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力見圖5（a）和圖5（b）。0.047 mmol/L GA及其烷基酯的DPPH自由基清除能力為（63.35±0.75）%~（69.19±0.68）%，ABTS自由基清除能力為（67.69±0.45）%~（74.42±0.62）%。可見，烷基鏈長對沒食子酸烷基酯在均相溶液中的抗氧化能力影響不大。

上述結果表明，在均相體系、散裝油體系和水包油乳液體系中，烷基鏈長對GA及其烷基酯的抗氧化性能有不同的影響。在均相溶液中，GA及其烷基酯通過酚羥基提供氫原子來清除自由基[19]。由于它們都有3個酚羥基。因此，其在均相溶液中的抗氧化性能相似。

然而，在散裝油體系和水包油乳液體系中，抗氧化劑的性能不僅與其化學性質有關，還與其物理性質有關。在散裝油體系中，抗氧化劑性能受其在油脂中的溶解度和油脂中存在的納米環境（微量水分和表面活性劑可組成反膠束，親水抗氧化劑易與其接近而發揮作用）的影響[20]。此外，Zhong等研究指出，抗氧化劑的濃度會進一步影響上述兩個影響因素[21]。在高濃度下，納米環境的影響大于抗氧化劑在油脂中溶解度的影響，因此親水抗氧化劑的效率優于疏水抗氧化劑，而在低濃度下則相反。作者使用的核桃油可能含有微量的水，因此可形成反膠束。同時，油樣中GA及其烷基酯的添加量為0.47 mmol/kg，是中國標準GB 2760—2014[9]允許的沒食子酸丙酯的最大添加量，濃度較高。因此，GA及其烷基酯在核桃油中的抗氧化性能隨鏈長（疏水性）的增加而下降，符合“極性悖論”[20]。

在水包油乳液體系中，由于油-水界面是氧化的關鍵位點，抗氧化劑在水相、油相和油-水界面的分配對抗氧化效率有關鍵影響。同時，抗氧化劑的分配會受到其疏水性的影響[22]。由于烷基酯的疏水性由其鏈長決定，在一定鏈長閾值范圍內的烷基酯更容易分布在油水界面上。因此，具有適當疏水性的GA-C2可以更好地集中在油水界面上發揮抗氧化作用。

圖4 沒食子酸及其烷基酯在核桃油中的抗氧化性能Fig.4 Antioxidant performances of GA and its alkyl esters in walnut oils

圖5 沒食子酸及其烷基酯的自由基清除能力Fig.5 Scavenging ability of GA and its alkyl esters

3 結語

在核桃油和水包核桃油乳液中，烷基鏈長對沒食子酸及其烷基酯的抗氧化能力影響不同。在水包核桃油乳液中，隨著烷基鏈長的增加，抗氧化效率先增加后下降，其中GA-C2的抗氧化效率最高，呈“截斷效應”。而在核桃油中，其抗氧化效率隨鏈長增加呈下降趨勢，但差異不顯著，符合“極性悖論”。這有助于選擇合適的抗氧化劑來穩定核桃油及其水包油乳液。