火麻油復合納米乳液的制備及穩定性研究

閆馨月，賈亦佳，孫詩艷，張東蒙，李 楊*，2

（1.東北農業大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150050）

火麻油富含多不飽和脂肪酸，主要為亞油酸和亞麻酸[1]。火麻油中n-6與n-3系脂肪酸質量比大致為4∶1~6∶1，與膳食營養素參考攝入量相符[2]。此外，火麻油富含氨基酸、礦物質、植物甾醇、生育酚等多種成分，營養價值豐富[3]。火麻油具有提高人體免疫力、抑制癌細胞生長、預防動脈粥樣硬化、抗菌消炎、延緩皮膚衰老等功能，被譽為“長壽油”，是一種潛在的藥食同源食品。火麻油易發生氧化酸敗，從而破壞其中的營養成分，并且造成風味損失。將火麻油制成納米乳液，可增強其穩定性，擴大適用范圍。大豆分離蛋白（SPI）因具有良好的乳化性和兩親性，較適用于制備水包油型納米乳液[4]，但是大豆分離蛋白單獨作為乳化劑制備納米乳液穩定性差[5]，通常情況下與其他乳化劑復配使用，如多糖[6]、大豆卵磷脂[7]。大豆卵磷脂是一種天然乳化劑，可增強大豆分離蛋白的乳化性，Mottola等發現，大豆卵磷脂與天然或變性大豆分離蛋白復配后可調節乳液的物理穩定性[8]。李秋慧等研究發現大豆分離蛋白與適量磷脂進行復合，可在水-油界面形成較穩定的薄膜，從而提高乳液的物理及氧化穩定性[9]。山柰酚是提取于姜科植物中的一類黃酮化合物[10]。山柰酚擁有較強的抗氧化性，可清除多種自由基，延緩衰老[11]。但其水溶性較差，臨床應用較難。因此，將山柰酚加入納米乳液，可以改善山柰酚的生物利用率，提高乳液的抗氧化能力。

納米乳液一般由水、油、乳化劑組成，有時會加入助乳化劑來調節乳液的穩定性[12]，納米乳液的動力學穩定性良好，在食品、化妝品、材料合成等領域得到了廣泛應用[13]。目前，制備納米乳液主要通過均質、超聲、微射流等方法。其中，超聲乳化優勢明顯，不僅操作簡單、成本低廉，而且制備的乳液粒徑小，穩定性高[14]。超聲乳化主要是因為聲場引起的界面波破壞了油水界面的穩定性，使油相以水滴的形式分離到水介質中。其次，空化氣泡的內爆產生沖擊波，引發連鎖反應，破碎分散的液滴使之粒徑減小，直到液滴達到非常穩定的乳化液的尺寸[15-16]。王霞等采用超聲技術制備了糖基化米糠蛋白納米乳液，并確定納米乳液的最佳制備條件，研究發現超聲乳化可提高納米乳液的穩定性[17]。

因此，作者使用大豆分離蛋白、卵磷脂以及山柰酚作為復合乳化劑制備火麻油復合納米乳液。通過表征乳液的構型變化及物理化學性質，研究了火麻油復合納米乳液的物理穩定性與氧化穩定性，為火麻油在食品工業中的應用提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆分離蛋白、卵磷脂、山柰酚：上海源葉生物科技有限公司產品；三氯乙酸、正己烷、石油醚、乙二胺四乙酸二鈉、硫代巴比妥酸：國藥集團化學試劑有限公司產品；1-苯胺基-8-萘磺酸（ANS）：Sigma公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 火麻油復合納米乳液的制備分別將大豆分離蛋白、卵磷脂和山柰酚用去離子水溶解，利用磁力攪拌器攪拌30 min。以體積比30∶3∶2混合均勻，再添加適量火麻油。使用IKA均質機在10 000 r/min下均質5 min。超聲波處理的方法參考文獻[18]并適當修改。將超聲波探頭伸入均質后的粗乳液中，距離容器底部5 mm處。超聲頻率20 kHz，輸出功率100、200、300、400 W，處理10 min，超聲時間與間隔時間分別為5 s和4 s。

1.2.2 粒徑及Zeta電位的測定參考文獻[19]的方法并適當修改。將乳液用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.5 mg/mL，采用粒度分析儀在室溫下對樣品的粒徑和Zeta電位進行測定。

1.2.3 內源熒光光譜的測定參照文獻[20]的方法并適當修改。將樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋至0.02 mg/mL后掃描。發射波長320~400 nm，激發波長285 nm，狹縫寬度2.0 nm，掃描速率2 000 nm/min。

1.2.4 表面疏水性的測定參照文獻[21]的方法，使用ANS法測量所有樣品溶液（pH 7.2）的表面疏水性（H0）。將樣品稀釋至0.005~2 mg/mL，黑暗中反應30 min后進行光度測量。以添加ANS的磷酸鹽緩沖液作為空白對照。激發波長和發射波長分別為380 nm和480 nm，縫隙寬度5 nm，樣品的H0為蛋白質質量濃度與熒光強度線性方程的斜率。

1.2.5 乳化活性及乳化穩定性的測定參照文獻[22]的方法并適當修改。將樣品用SDS溶液（質量分數0.1%）稀釋100倍并混合均勻，以SDS標準溶液作為空白對照。在500 nm處測定吸光度，計為A0。靜置10 min再次測定吸光度，記為A10，計算乳化活性（EAI）和乳化穩定性（ESI）。

式中：ρ為樣品質量濃度，g/mL；φ為乳液與油相的體積比，φ=0.25；L為比色杯直徑，cm；N為稀釋倍數；A0為乳液的初始吸光度；A10為10 min時的吸光度；T為乳液靜置時間，min。

1.2.6 乳析指數的測定用乳析指數表征分層程度，取新鮮乳液于15 mL透明玻璃瓶中，旋緊玻璃蓋以防樣品蒸發。室溫避光儲存，在3、6、9、12、15 d時進行觀察，計算乳析指數。

式中：CI為乳析指數，%；HS為上層乳化層的高度，cm；HE為乳液總高度，cm。

1.2.7 抗氧化活性的測定

1）DPPH自由基清除率 參考文獻[23]的方法適當修改。準確稱取3.5 mg DPPH，用甲醇定容至10 mL，獲得DPPH原始溶液。每次使用前將溶液稀釋，獲得DPPH實驗溶液。測定時，將樣品用甲醇稀釋至合適質量濃度，再與適量DPPH實驗溶液混勻，避光靜置30 min。在517 nm處測定吸光度（A3），以純乳液吸光度（A2）為樣品對照組，DPPH-甲醇吸光度（A1）為空白組，甲醇吸光度（A0）為空白對照組。分別測定吸光度，計算DPPH自由基清除率。

2）ABTS自由基清除率 參考文獻[24]的方法并適當修改。取0.5 mL樣品加入4 mL ABTS工作液，避光靜置50 min。在734 nm處測定吸光度（A3），以純乳液吸光度（A2）為樣品對照組，ABTS-甲醇吸光度（A1）為空白組，甲醇吸光度（A0）為空白對照組。分別測定吸光度，計算ABTS自由基清除率。

1.2.8 氧化穩定性的測定

1）初級氧化產物 參照文獻[25]的方法，將6 mL異辛烷-異丙醇（體積比2∶1）混合液加到適量樣品中，振蕩混勻后在6 000 r/min下離心。取出上層溶液，添加甲醇-正丁醇（體積比2∶1）混合液至10 mL，再加入40μL硫氰酸鉀溶液（3.94 mol/L）和40 μL硫酸亞鐵溶液（0.144 mol/L），避光反應30 min，在510 nm處測定吸光度。以純凈火麻油作為對照。脂質氫過氧化物的濃度（以POV表示）根據異丙苯過氧化氫標準品繪制的標準曲線計算。

2）次級氧化產物 參照文獻[26]的方法。將4 mL TBARS測試液（質量分數15%三氯乙酸與質量分數0.375%硫代巴比妥酸溶于0.25 mol/L HCl）加到2 mL乳液中。沸水加熱20 min后冷卻至室溫，用直徑1.2μm的微孔濾膜過濾，取適量濾液于532 nm處測定吸光度。以純凈火麻油作為對照。乳液中硫代巴比妥酸（TBA）的質量分數通過1，1，3，3-四乙氧基丙烷標準品繪制的標準曲線計算。

1.3 數據統計分析

所有實驗數據均在測定3次后得出，結果表示為平均值±標準差。數據統計分析采用SPSS 18.5軟件，P＜0.05為差異顯著。繪圖采用Origin 9.1軟件。

2 結果與分析

2.1 粒徑及Zeta電位

不同超聲功率對火麻油復合納米乳液的平均粒徑、多分散性指數（PDI）以及Zeta電位的影響見表1。當超聲功率逐漸提高至300 W時，乳液的平均粒徑由未超聲處理的2 262.00 nm降低到804.33 nm。這是由于超聲處理產生了較強的空化效應和湍流作用，使乳液顆粒尺寸減小[27]。然而，超聲功率達到400 W時，平均粒徑并未繼續減小。推測原因可能是蛋白質經過一段時間的高功率處理后分子間重新聚集，這與Kentish等研究結果相一致[28]。通常復合乳液液滴的平均粒徑越小，對應的PDI也會越低[29]。因此當超聲功率達到300 W時，PDI為0.183，遠小于未經超聲處理樣品的0.676。說明超聲處理后，納米乳液的粒徑分布更加集中，在此范圍內的液滴分散性提高，體系穩定性隨之增加。

Zeta電位用來表征復合物的電負性。通過測定樣品表面的電荷數量，確定粒子間的靜電相互作用，進而明確穩定體系的作用力。如表1所示，當超聲功率在300 W時，乳液顆粒表面帶電數量最多。說明在此條件下，納米顆粒間具有強烈的靜電作用。原因在于適當的超聲處理使復合物粒徑減小，顆粒的比表面積增大，暴露出更多的帶電殘基，導致靜電作用增強[30]。靜電相互作用的提高會破壞復合乳液中的大分子聚集體，改善體系的穩定性。

表1 不同超聲處理條件下火麻油復合納米乳液的物理性質Table 1 Physical properties of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.2 內源熒光光譜

內源熒光是通過觀察光譜的強度以及最大發射波長的位置來分析蛋白質構象變化的方法[31]。以SPI的色氨酸（Trp）殘基作為發色基團，研究超聲處理后蛋白質三級結構的變化。不同超聲功率處理樣品的熒光強度發生顯著變化（見圖1）。隨著功率的提高，熒光強度逐漸增加。原因可能是超聲處理使蛋白質結構發生解聚，空間構象變得更加舒展。原本包埋在蛋白質內部的Trp殘基暴露于分子表面，導致熒光強度增加。超聲功率由0增加到400 W的過程中，光譜逐漸紅移。表明超聲處理主要影響SPI的三級結構，功率的增加使芳香族氨基酸處于極性更強的微環境。

圖1 不同超聲處理條件下火麻油復合納米乳液的內源熒光光譜Fig.1 Intrinsic fluorescence spectra of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.3 表面疏水性

ANS是檢測蛋白質結構狀態的敏感性探針，處理后的樣品折疊程度越高則熒光發射強度越大。H0可以直觀地表示蛋白質表面的疏水基團數目，同時可以間接表明蛋白質構象、功能以及體系穩定性的變化[32]。如表1所示，超聲功率提高的同時H0也隨之增加，未經超聲處理的樣品H0最低（7 411.06）。推測原因可能是疏水性殘基被親水基團包裹，封裝在大豆分離蛋白的結構內部。當功率為400 W時H0增大至17 140.16。出現這種結果可能是超聲處理導致蛋白質的亞基解離以及肽鏈的部分擴張，使得內部疏水性殘基游離于分子表面。Wu等利用不同的超聲波功率加工扇貝中的蛋白質也發現了類似的結果[33]。

2.4 乳化活性及乳化穩定性

乳化性與蛋白質在油-水界面上的吸附、擴散和重排有關，是蛋白質的界面性質之一。其中EAI表示蛋白質在水相中的溶解性以及磷脂在油-水界面的成膜性；ESI是指油-水界面聚集并穩定小液滴的能力[34]。圖2為復合納米乳液的EAI和ESI。與未超聲處理的樣品相比，超聲處理納米乳液的EAI及ESI均顯著提高（P＜0.05）。這是因為處理后的樣品結構進一步伸展，內部組織暴露于表面，柔性結構的區域發生變化。分子形態由緊湊的球狀轉變為松散結構，有利于更多的蛋白質吸附在油水界面。因此，超聲處理的樣品EAI增大。同時，根據復合體系粒徑的研究結果表明（見表1），超聲處理后樣品的粒徑逐漸減小，使得蛋白質吸附到油水界面的速度加快，進一步降低界面張力，導致形成的小液滴持續聚集并且難以破裂，因此ESI得到改善。Greta等也發現超聲波可以改變蛋白質分子的結構，提高H0從而改善蛋白質的乳化性能[35]。當超聲功率達到400 W時，復合納米乳液的EAI和ESI都有降低的趨勢。推測原因可能是高強度超聲使蛋白質輕微變性，形成不溶性聚集體。由于聚集體表面電荷分布不均勻，導致蛋白質顆粒受到靜電斥力而脫離油-水界面，造成體系乳化性能下降。

2.5 乳析指數

乳析指數是表征乳液中油-水兩相的聚集或分散程度，是評價體系儲存穩定性的重要指標。儲存15 d內不同超聲功率處理條件下火麻油復合納米乳液的CI變化見圖3。未經超聲處理的乳液在儲存3 d后具有明顯分層，而經過超聲處理的樣品僅有輕微分層現象。隨著儲存時間的延長，所有樣品的CI都出現不同程度的增加。超聲功率為0的樣品變化最明顯，而超聲功率較大的樣品增加幅度較小。推測可能是由于超聲處理的空化作用產生劇烈的物理效應（微射流、剪切力、沖擊波、湍流等）和高活性的自由基，這些自由基可以攻擊蛋白質分子的側鏈和骨干結構，導致蛋白質結構發生變化。進一步增強SPI與磷脂的相互作用，有助于形成界面吸附膜，提高乳液的穩定性[36]。

圖2 不同超聲處理條件下火麻油復合納米乳液的EAI及ESIFig.2 Emulsifying activity and emulsion stability of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

圖3 不同超聲處理條件下火麻油復合納米乳液的乳析指數Fig.3 Creaming index of hemp seed oil composite nanoemulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.6 抗氧化活性

DPPH是一種穩定的自由基，當抗氧化劑存在時，DPPH接受一個電子或氫離子形成穩定的DPPH-H化合物，褪色程度反映了抗氧化劑的清除能力[37]。如圖4所示，火麻油復合納米乳液在經過超聲處理后的DPPH自由基清除率均大于未經處理的樣品。可能的原因是超聲處理后大豆分離蛋白的空間構象改變，暴露了大量具有抗氧化活性的氨基酸。超聲功率為400 W時，樣品的抗氧化能力出現下降的趨勢。原因可能是過度超聲使蛋白質形成較大的聚集體，導致樣品的溶解度下降。因此，DPPH自由基清除能力較弱。

ABTS自由基清除原理類似于DPPH，同樣是與自由基清除劑反應導致體系褪色。ABTS自由基的變化趨勢與DPPH相似（見圖4）。有研究指出抗氧化能力包括斷鏈和供氫兩種能力[37]。因此，該實驗結果表明不同超聲功率處理復合納米乳液對這兩種能力有一定影響。

圖4 不同超聲處理條件下火麻油復合納米乳液的抗氧化活性Fig.4 Oxidative activity of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.7 氧化穩定性

氧化穩定性是評價油脂質量的重要參數之一，作者研究了45℃加速氧化條件對火麻油復合納米乳液POV和TBA的影響（見圖5）。在初始階段，樣品的POV幾乎為零。隨著時間延長，各組分的POV均緩慢增加。第4天，火麻油的POV迅速攀升，并與火麻油復合納米乳液形成顯著差異。第8天，與超聲處理樣品相比，未經超聲處理樣品的POV也出現大幅增長。經過14 d儲存后，火麻油的POV是復合納米乳液的2倍。由此可見，火麻油與其他大分子物質復合后被包埋在內部，可以有效阻止油脂接觸外界氧氣，減緩氧化速度，延長儲存時間[38]。未經超聲處理樣品的POV是超聲功率為300 W樣品的1.84倍。原因可能是適當超聲處理使火麻油與其他大分子物質的結合更加緊密，表面存在的油脂減少，氧氣可以攻擊的位點數量下降。

油脂氧化產物的不穩定性使其容易分解成醛、酮、醇和酸類等小分子物質[39]，這些物質對食品的風味、色澤、口感和質量均有消極影響，同時會產生自由基等有害物質，引發慢性疾病[40]。TBA法是測定不飽和脂肪酸自動氧化產物的常用方法[41]。如圖5（b）所示，45℃加速氧化條件下，火麻油及復合納米乳液的TBA隨著時間的推移而增加。TBA的變化趨勢與POV類似。這一結果與陳雅琪等關于南瓜子油乳液的制備及穩定性的研究結果一致[39]。原因可能是由于體系中的乳化劑將火麻油包裹在液滴內，避免了油脂與氧氣以及促氧化物質的接觸。

圖5 不同超聲處理條件下火麻油復合納米乳液的氧化穩定性Fig.5 Oxidative stability of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

3 結 語

以火麻油作為油相，大豆分離蛋白、卵磷脂、山柰酚作為乳化劑，應用超聲處理制備火麻油復合納米乳液。探究不同超聲功率（100、200、300、400 W）對乳液穩定性的影響，揭示復合體系穩定性隨超聲條件變化的規律。通過對乳液粒徑、PDI、Zeta電位、內源熒光光譜、H0、乳化性、CI以及氧化穩定性的測定發現，當超聲功率為300 W時，由于超聲處理的空化作用使體系分散均勻，蛋白質內部的疏水性殘基暴露于表面，乳液的內源熒光光譜紅移，熒光強度與H0均提高，并且具有較好的物理穩定性和氧化穩定性。隨著功率增大至400 W，蛋白質聚集，弱化與其他大分子的相互作用，導致復合體系的穩定性下降。這表明適當的超聲處理（300 W）可以改善復合乳液的儲存特性。該結果為提高火麻油的穩定性，延長產品貨架期提出了可行的思路。同時為超聲技術運用于產品的加工提供一定的理論依據。