酶法催化甘油解制備亞麻籽油甘油二酯及其氧化穩定性分析

孫曉雪，汪 勇，崔立明，張 震*

（1.暨南大學 理工學院，廣東 廣州 510632；2.脂代科技（北京）有限公司，北京 100083）

亞麻，是世界上十大油料作物之一，在全世界均有分布，主要包括美國、加拿大、阿根廷和中國。在我國，亞麻屬于傳統的油料作物，主要分布于西北、華北等地區[1]。亞麻籽是亞麻的種子，根據地區和品種的不同，亞麻籽含油率為20%～40%。亞麻籽油含有豐富的n-3不飽和脂肪酸，占總氨基酸質量的50%左右[2]。大量科學研究表明亞麻籽油對人體營養健康具有重要的作用，在抗炎、降血壓、降血脂與降膽固醇、抑制癌癥的產生和轉移、改善糖尿病、提高記憶力、改善視力等方面具有積極作用[3]。當前我國居民n-3不飽和脂肪酸攝入較少，長期攝入不足會導致身體處于亞健康狀態，因此開發富含n-3不飽和脂肪酸的亞麻籽油產品在未來具有廣闊的應用前景。

甘油二酯是天然油脂中存在的微量成分，是油脂代謝的中間產物，由兩分子脂肪酸與甘油骨架組合而成，包括1，3-DAG和1，2（2，3）-DAG兩種異構體。其中1，3-DAG具有較高的營養價值，在體內的代謝途徑不同于傳統甘油三酯，攝入后難以再合成中性脂肪，最終以CO2和H2O的形式釋放。對于控制體內脂肪積累、降低血脂和餐后血糖效果顯著[4]。1，2（2，3）-DAG是體內合成磷脂和甘油三酯（triacylglycerol，TAG）的前體物質，還可以通過合成心肌蛋白質改善心肌功能紊亂。1992年，日本花王公司推出DAG油，被日本政府許可為保健食品。2000年，美國食品藥品監督管理局將DAG批準為公認安全性食品，可用作食用油。2021年DAG被中華人民共和國國家衛生健康委員會列入“新食品原料終止審查目錄”中，意味著中國對DAG安全性和功能性的認可。關于DAG早期的研究主要圍繞其作為表面活性劑的特性，近年來隨著研究深入，關于DAG營養價值的研究也越來越多，研究發現DAG在人體內可以增加脂肪酸的β氧化，影響脂代謝相關基因的表達，具有減肥、降血脂、抑制脂肪堆積、調節胰島素水平等功能[5]。1，3-DAG和TAG在人體內的生物利用度和吸收率相似，在進入人體后都會被水解產生脂肪酸，從而被人體消化吸收，因此亞麻籽油DAG在進入人體后，其中的n-3不飽和脂肪酸仍能被人體吸收，發揮其功效。若能將DAG與亞麻籽油的優點相結合，生產出既具有DAG功能特性又具有亞麻籽油營養特性的功能性油脂，對中國未來健康油脂的發展具有重要意義。

目前，DAG的制備主要包括化學法和酶法，其中酶法制備DAG因為反應條件溫和，不需要使用大量有機試劑，安全性高而受到廣泛關注。酶法制備方法主要包括：直接酯化法、甘油解法、水解法和酯交換法[6-7]。其中甘油解反應過程簡單、原料來源豐富。作者以亞麻籽油和甘油為原料，Lipozyme CALB酶為催化劑，采用甘油解反應制備DAG，探究適宜的制備工藝條件，通過分子蒸餾脫除游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）和單甘酯（monoacylglycerol，MAG），得到精制DAG產品。同時，因為亞麻籽油DAG不飽和脂肪酸含量較多，容易發生氧化反應，導致油脂變質，利用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）對添加抗氧化劑前后的亞麻籽油DAG的氧化穩定性進行研究，為產品貨架期的預測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級亞麻籽油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司產品；Lipozyme CALB：諾維信（中國）生物科技有限公司產品；甘油、正己烷（分析純）：天津市大茂化學試劑廠產品；TBHQ：廣東廣業清怡食品科技有限公司產品。

1.2 儀器與設備

GC-7820A氣相色譜儀（gas chromatography，GC）：美國Agilent公司產品；MD-80分子蒸餾：廣州市漢維儀器設備有限公司產品；OS20-S數顯型頂置式強力電子攪拌器：美國SCILOGEX公司產品；DSC-1型差示掃描量熱儀：梅特勒-托利多公司產品；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司產品；KDC-220HR高速冷凍離心機：高教研（北京）科技有限公司產品；IKA HS-10磁力加熱攪拌器：德國IKA設備有限公司產品。

1.3 研究方法

1.3.1 亞麻籽油DAG的制備稱取亞麻籽油、甘油、Lipozyme CALB酶于250 mL錐形瓶中，在80℃、300 r/min條件下攪拌反應一段時間。反應結束后，將產物移入離心管，以10 000 r/min離心10 min。收集上清液加熱10 min使殘留的酶失活，得到亞麻籽油DAG。

1.3.2 單因素實驗設計以亞麻籽油為原料，DAG質量分數為指標，分別對酶添加量、反應溫度、反應時間、底物物質的量比、初始加水量5個單因素進行甘油解制備亞麻籽油DAG工藝探究，單因素實驗設計見表1。

表1 單因素實驗設計表Table 1 Single factor test design

1.3.3 反應產物中甘油酯組成分析參考文獻[8]的方法對甘油解制備樣品的甘油酯組成進行分析。取50 mg甘油酯樣品，用5.0 mL正己烷將其完全溶解，將溶液通過濾膜過濾于樣品瓶中。樣品制備完畢后置于GC檢測。GC條件：DB-1ht毛細管柱（15 m×0.25 mm×0.1μm），進樣量1μL，分流比40∶1；柱箱溫度50℃，離子火焰檢測器溫度380℃；載氣為N2，流量4.17 mL/min。階段性程序升溫檢測：初始溫度50℃，保持1 min，然后以50℃/min升至100℃，80℃/min升至220℃，30℃/min升至290℃，50℃/min升至330℃，保持2 min，最后以50℃/min升至380℃并保持3 min。采用面積歸一化法分別對FFA、MAG、DAG和TAG進行定量分析。

1.3.4 分子蒸餾技術應用分子蒸餾是一種有效的分離純化技術，與大多數純化方法相比，分子蒸餾溫度低、真空度高、物料受熱時間短，可以保持原有物質的功能特性，可在不顯著改變油脂品質的情況下，提高甘油酯混合物中DAG含量[9]。在該實驗中，經離心后的上層反應液含有未反應的TAG以及生成的FFA、MAG、DAG。通過分子蒸餾從制備的甘油酯混合物中純化DAG。利用分子蒸餾能夠通過輕相去除絕大部分FFA和MAG，但因為自由程相近，較難分離DAG和TAG，因此重相組分中DAG占比更為重要。所以，重相組分中DAG與TAG的比值越大，分子蒸餾后，DAG的純度越高。參考Zhang等的方法采用分子蒸餾對甘油酯進行純化[10]，參數設定見表2。

表2 分子蒸餾儀器參數表Table 2 Molecular distillation parameters

1.3.5 脂肪酸組成分析參考Zhou等方法采用GC對樣品的脂肪酸組成進行分析[11]。使用氫氧化鉀-甲醇溶液和正己烷溶液對油樣進行甲酯化，使脂肪酸轉化為脂肪酸甲酯，進行GC分析確定脂肪酸組成。GC條件：CP-sil88毛細管柱（100 m×0.25 mm×0.2μm），進樣量1μL，分流比40∶1；柱箱溫度80℃，離子火焰檢測器溫度240℃；載氣為N2，流量4.17 mL/min。階段性程序升溫檢測：初始溫度120℃，保持3 min，以8℃/min升至175℃，保持18 min。通過標準樣品法和面積歸一化法分別對脂肪酸進行定性和定量分析。

1.3.6 氧化穩定性測定通過控制DSC的程序溫度和空氣流量，可以測定油脂樣品在特定條件下氧化時的放熱趨勢，從而得到樣品熱功率與溫度和時間的關系，根據放熱峰初始處的最大斜率切線與外推基線的交點，能夠獲得樣品的起始氧化溫度和誘導時間[12]。

起始氧化溫度測定：參考Rudnik等的方法[13]。設定升溫速率為10℃/min，溫度從120℃升至300℃，空氣流量30 mL/min。起始氧化溫度在DSC曲線圖上表現為氧化反應前外推基線與反應時放熱峰初始最大斜率切線相交點對應的溫度。

氧化誘導時間測定：稱取（10±2）mg樣品置于鋁坩堝內密封，為便于空氣進入，蓋頂扎孔，設置空鋁坩堝為對照。設置等溫氧化溫度為90、100、110、120℃，先將樣品在30 mL/min的N2環境下升溫到設定溫度，保持5 min，然后通入相同流量的空氣。氧化誘導時間為氧化反應前外推基線與氧化反應過程最大斜率的切線相交時的對應時間。

動力學數據分析采用Kaseke等的方法[14]。溫度與油脂氧化反應速率的關系由Arrhenius方程表示。

式中：k為氧化反應速率常數（氧化誘導時間倒數）；A為指前因子；Ea為活化能，kJ/mol；R為摩爾氣體常數，8.314 J/（mol·K）。對ln k和1/T擬合生成線性方程，活化能和頻率因子可通過方程的斜率和截距計算得到。

1.3.7 實驗數據處理與統計分析各組實驗重復3次，采用均值±標準差表示實驗結果。使用SPSS 26.0軟件對結果進行差異性分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 底物物質的量比對DAG得率影響在反應溫度80℃、初始加水量（質量分數）8%、反應時間3 h、加酶量（質量分數）1.0%條件下，考察甘油與亞麻籽油物質的量比（25∶1、20∶1、15∶1、7.5∶1、5∶1）對甘油解反應生成DAG的影響，結果見圖1。隨著甘油添加量的減少，DAG呈先增加后降低的趨勢，TAG先減少再增加。當底物物質的量比為20∶1時，DAG質量分數達到最大，為24.61%，TAG質量分數最少，為73.74%，DAG與TAG比值為0.33。再減少甘油添加量，DAG反而減少。這可能是因為甘油解反應為可逆反應，在甘油添加量較低時，甘油含量的增加可以使底物增加，促進反應向正方向進行[15]。但是甘油含量過高時，體系黏度過大，影響攪拌效果，導致各物質接觸不夠充分，反而降低了反應速率。因此，選擇甘油和亞麻籽油的物質的量比為20∶1。

2.1.2 反應溫度對DAG得率影響在底物物質的量比20∶1、初始加水量（質量分數）8%、反應時間3 h、加酶量（質量分數）1.0%條件下，考察反應溫度（70、75、80、85、90℃）對甘油解反應生成DAG的影響，結果見圖2。反應溫度在70~80℃時，DAG隨反應溫度升高而增加，TAG不斷減少，這是因為當反應溫度升高時，混合體系黏度降低，酶與底物分子之間的碰撞加劇，反應速率增加，反應向正方向進行[16]；在80℃時，DAG質量分數達到最大24.61%，即為Lipozyme CALB的最適催化溫度；超過80℃后，DAG隨反應溫度升高而減少，TAG增加，酶的催化效果降低。因為當反應溫度高于最適溫度時，酶被鈍化，導致酶催化活力下降，不利于甘油解反應進行[17]。因此，選擇反應溫度為80℃。

圖1 甘油與亞麻籽油物質的量比對反應產物中各組分的影響Fig.1 Effect of molar ratio of glycerol to flaxseed oil on the components of reaction products

2.1.3 初始加水量對DAG得率影響在底物物質的量比20∶1、反應溫度80℃、反應時間3 h、加酶量（質量分數）1.0%條件下，考察初始加水量（質量分數為0、2%、4%、6%、8%、10%）對甘油解反應生成DAG的影響，結果見圖3。隨著初始加水量的增加，DAG生成量逐漸降低，并在加水量達到6%后趨于平緩。初始加水量對酶解反應有一定影響，反應初始階段加入一定量的水分，能夠幫助酶分子維持其構象，發揮催化活性[18]。但是在實驗中，初始加水量從0增加至10%，產物DAG質量分數從29.06%降至20.43%，而TAG含量依舊保持較高水平。這可能是因為微量的游離水分即可滿足催化甘油解反應的條件，對于Lipozyme CALB酶來說，其本身含水量較高，不需要額外添加水分即可達到較好的催化效果，過多的水分反而影響酶的活性[19]。因此，選擇初始加水量為0。

圖3 初始加水量對反應產物中各組分的影響Fig.3 Effect of initial water content on the components of reaction products

2.1.4 酶添加量對DAG得率影響在底物物質的量比20∶1、反應溫度80℃、反應時間3 h、初始加水量為0的條件下，考察酶添加量（質量分數為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對甘油解反應生成DAG的影響，結果見圖4。當加酶量從1.0%提高到2.0%時，TAG降低，促進了TAG進行甘油解反應，生成DAG。由此可見，在酶質量濃度比較低時，隨著酶添加量的增加，甘油解速率也在不斷增加。當加酶量為2.0%時，DAG質量分數達到最大，為36.29%，此時DAG與TAG比值為0.70。當加酶量從2.0%增加到3.0%時，DAG質量分數處于穩定狀態，并略有降低，這可能是因為當反應中酶質量濃度較高時會發生酶分子聚結[20]，進而導致反應速率降低。因此，選擇酶添加量為2.0%。

2.1.5 反應時間對DAG得率影響在底物物質的量比20∶1、反應溫度80℃、初始加水量為0、加酶量（質量分數）2.0%條件下，考察反應時間（3、6、8、10、12 h）對甘油解反應生成DAG的影響，結果見圖5。隨著反應時間的延長，DAG呈現先增加后減少的趨勢，TAG先減少后增加，MAG逐漸上升。在反應前10 h內，反應向有利于DAG生成的方向進行；反應時間為10 h時，DAG質量分數達到最大47.13%，此時TAG質量分數為33.98%，DAG與TAG比值為1.39；之后隨著反應時間的延長，DAG開始下降，生成越來越多的TAG。但是在整個過程中，MAG質量分數呈上升趨勢，從11.37%上升至18.63%，FFA質量分數始終較低。這說明，在反應初始階段脂肪酸不斷從TAG上被分解下來，并與甘油相結合，從而生成MAG和DAG。繼續延長反應時間至12 h，DAG開始下降。這可能是因為反應時間超過10 h后，DAG的形成速率低于分解速率，導致質量分數降低[21]，同時隨著反應時間的延長，酶蛋白質結構也會發生改變，導致酶活力降低[22]。因此，選擇反應時間為10 h。

圖4 酶添加量對反應產物中各組分的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the components of reaction products

圖5 反應時間對反應產物中各組分的影響Fig.5 Effect of reaction time on the components of reaction products

2.2 氧化穩定性測定

2.2.1 DAG的純化采用GC對分子蒸餾前后樣品的甘油酯組成與質量分數變化進行分析，結果見表3。經分子蒸餾純化后，樣品中的甘油酯組分發生了明顯變化。分子蒸餾前樣品中FFA質量分數為0.61%，MAG質量分數為18.28%，DAG質量分數為47.13%，TAG質量分數為33.98%。經過分子蒸餾后，產物中只剩DAG和TAG，DAG質量分數上升為57.18%。說明經分子蒸餾后，可除去FFA和MAG，達到純化DAG的目的。

表3 分子蒸餾前后甘油酯組成及質量分數Table 3 Composition and mass fraction of acylglycerols before and after molecular distillation

2.2.2 脂肪酸組成分析油脂的氧化穩定性與脂肪酸組成有關，不飽和脂肪酸含量越高，油脂越容易氧化。采用GC對樣品脂肪酸組成進行分析，結果見表4。對比原料亞麻籽油和分子蒸餾前后亞麻籽油DAG脂肪酸組成可知，脂肪酸種類沒有發生變化，質量分數略有變化。其中亞麻酸（n-3脂肪酸）在經過甘油解反應得到的DAG中略有降低，由54.58%降低至53.27%。經過分子蒸餾純化后脂肪酸組成沒有明顯變化，亞麻籽油DAG的脂肪酸仍以亞麻酸為主。

表4 不同樣品脂肪酸組成Table 4 Fatty acids compositions of different samples

2.2.3 油脂樣品起始氧化溫度和氧化誘導時間由DSC曲線（見圖6）得到樣品的起始氧化溫度為139.8℃。因此，選擇低于起始氧化溫度20~50℃的溫度，即90~120℃作為測定氧化誘導時間的等溫溫度[12]，進行氧化穩定性分析。

圖6 產品亞麻籽油DAG的氧化曲線Fig.6 Oxidation curve of DAG prepared from flaxseed oil

通過測定油脂樣品氧化誘導時間的長短，可以了解油脂的氧化穩定性，誘導時間越長表明油脂的氧化穩定性越好，誘導時間越短，油脂氧化穩定性越差。以TBHQ（0.20 g/L）作為抗氧化劑，通過DSC法測定添加前后的亞麻籽油DAG氧化誘導時間結果見表5。根據氧化誘導時間的倒數確定樣品的氧化反應速率常數k，見表6。

從表5和表6可以看出，隨著氧化溫度的升高，樣品的氧化誘導時間減少，反應速率常數k增加，說明氧化反應隨著溫度的升高而加劇。

表5 不同等溫溫度下氧化誘導時間Table 5 Oxidation induction time at different isothermal temperatures

表6 不同等溫溫度下的氧化反應速率常數kTable 6 Reaction rate constants k at different isothermal temperatures

2.2.4 貨架期的預測將lg k與反應溫度T最小二乘法回歸可得到回歸方程，對ln k和1/T擬合生成線性方程，根據斜率計算得到Ea，見表7。

由表可知，lg k與反應溫度T呈線性相關，根據回歸方程可以預測特定溫度下的反應速率常數k或氧化誘導時間。因此，將25℃代入回歸方程，通過計算可以得到在室溫條件下，不添加抗氧化劑的亞麻籽油DAG理論貨架期僅為2.63×104min，約37 d，添加抗氧化劑TBHQ的亞麻籽油DAG理論貨架期可延長至7.81×104min，約109 d，說明TBHQ對DAG的氧化穩定性具有顯著提升效果。因為溫度等外部因素對氧化的影響能夠量化，所以通過加速氧化實驗可以預測室溫下油脂的氧化穩定時間[23]，獲得理論貨架期。

表7 lg k與T回歸方程、25℃下理論貨架期及E aTable 7 Regression equation of lg k and T,the theoretical shelf life and E a at 25℃

由此可知，DSC可以快速準確地測定油脂的理論貨架期，其樣品用量少、測試時間短、不需要消耗化學試劑、自動化程度高、操作簡便，有利于油脂產品的質量監控和預測油脂樣品的氧化穩定時間[24]。

3 結語

作者對亞麻籽油DAG的甘油解制備條件和制得DAG的氧化穩定性進行了研究。通過單因素實驗得到了制備較高純度DAG的適宜條件，在反應時間10 h，反應溫度80℃，甘油與亞麻籽油物質的量比20∶1，加酶量（質量分數）2.0%的條件下反應，利用分子蒸餾精制得到了質量分數為57.18%的亞麻籽油DAG，產物中亞麻酸質量分數為52.75%。利用DSC法對亞麻籽油DAG的氧化穩定性進行了研究，通過添加TBHQ作為抗氧化劑，顯著增強了亞麻籽油DAG的氧化穩定性，理論貨架期能夠延長至109 d。