火麻油水解提取多酚工藝優化及多酚對線蟲行為能力的影響

姚鑒芯，張哲皓，張 帥，劉元法，徐勇將*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.中國焙烤食品糖制品工業協會，北京 100833）

火麻（Cannabis sativa L.），俗稱大麻、線麻、山絲苗等，桑科，大麻屬，一年生草本植物。火麻的主要成分為脂肪酸、大麻素以及一些碳水化合物和微量元素[1-2]。火麻油可由火麻子直接壓榨而得，油呈黃綠色且具有特殊的清香。根據干燥時烘箱的溫度差異，壓榨可分為冷榨和熱榨，熱榨油比冷榨油顏色更深。除此之外，還可通過加水酶解和溶劑浸出的方式得到火麻油。水酶法和浸出法制得的火麻油顏色較清亮，比壓榨制油的色澤更好，但是出油率更低一些。不同加工方式制備的火麻油在總酚質量分數、理化指標、感官評定等方面都有差異，尋求一種綜合評定較好且更具發展前景的加工方式，可以得到品質更優，更符合當下健康飲食需求的火麻油產品。

火麻油含有酚類化合物及生育酚，其抗氧化活性因為這類活性物質的存在而提高。研究發現，酚類物質可以有效預防一些慢性疾病，如肥胖、高血壓、高血脂、心腦血管疾病等，對癌癥、炎癥等疾病的抵抗與治療也發揮著積極作用[3-4]。植物油中酚類物質的存在，使得油脂的氧化穩定性較好，儲藏期相對較長，可以長久地保持油的穩定色澤與感官品質[5]。不同加工方式制油測得的酚類化合物含量不同，其中水酶法和熱榨制油總酚質量分數最高，同時，水酶法制油的呈色明顯優于熱榨制油，如果對其進行工藝優化，有望成為較理想的制油方法。

熱榨、冷榨、水酶、浸出4種制油方式中，水酶法制油兼具環境友好、有益副產物多、安全性高、反應條件溫和、節能、無有機溶劑殘留、總酚含量高等優點，有利于環境保護和提升油脂品質[6]。為得到營養價值更高的油脂產品，作者選擇Alacalase 2.4 L蛋白酶水解火麻子，提取火麻油，以總酚質量分數為優化指標，用單因素實驗對加酶量、液料比、酶解pH 3個影響因素進行研究，并用響應面法進行優化[7]。

以總酚為指標優化水酶法提油工藝后，需進一步檢驗其可行性：包括方法選擇的生物適用性與酚類物質的生物活性作用。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種以細菌為食的多細胞動物，對生長環境要求不高，有較強的環境抵抗力，適用于實驗室的培養條件，被國際公認為脂質代謝的模式生物之一。秀麗隱桿線蟲具有很多研究優點：如生長周期短，蟲體結構簡單；在顯微鏡下呈透明狀，便于染色和觀察；和人體具有40%以上的同源性基因，發育繁殖快，后代多且易于保存；遺傳背景清晰，進化高度保守；培育方式簡單，成本低廉等[1，3，8-9]。因此，選擇秀麗隱桿線蟲作為研究的模式生物。

對于線蟲這類模式生物而言，選擇合適的模型用于研究，才更易于檢驗活性成分的功能。氧化損傷是一些惡性疾病發展與生命體衰老的重要原因，活性氧ROS和抗氧化防御系統的不穩定狀態會引起機體的過氧化，破壞細胞并產生病理性蛋白質[3，10-12]。近年來，已有多種具有抗氧化功能的物質用于研究治療線蟲的氧化應激損傷，如紅茶、蝦青素、海帶提取物中的對百草枯、姜黃素類化合物等[13-16]。根據酚類物質在油脂中的抗氧化作用，推測不同加工方式制取的火麻油因總酚含量的差異會對線蟲氧化應激損傷起到不同的治療效果。因此，選擇H2O2溶液處理同步化生長的野生型線蟲，模擬線蟲內源性的氧化應激損傷[10-12]，建立線蟲運動缺陷模型，將其轉移至涂布不同加工方式所得火麻油的培養基上，待幼蟲成年后，測定其行為能力，探究加工方式以及油中的酚類物質對線蟲的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑火麻子：購自廣西壯族自治區巴馬瑤族自治縣；Alacalase 2.4 L蛋白酶：諾維信生物技術有限公司產品；野生型秀麗隱桿線蟲、大腸桿菌E.coli OP50：來自江南大學孫秀蘭教授實驗室；質量分數30%H2O2溶液、二甲基亞砜、乙醇、甲醇、正己烷、氯化鈉、胰蛋白胨、瓊脂、碳酸鈉、NaOH、鹽酸、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、福林酚、膽固醇、酵母粉（均為分析純）：國藥化學試劑集團產品；二醇基固相萃取（Diol-SPE）小柱：上海安譜實驗科技股份公司產品。

1.1.2 設備與儀器FD56干燥箱：德國Binder公司產品；DF-8L氮吹設備：杭州德爾克設備有限公司產品；YX-18HDD蒸汽滅菌鍋：蘇州奧普實驗設備有限公司產品；scientz-IID超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技公司產品；mini-240紫外分光光度計：美國Zeiss公司產品；SW-CJ-1FD-Ⅱ生物安全柜：蘇凈安泰有限公司產品；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司產品；S8專業商用榨油機：東莞香聚智能有限公司產品；旭曼800Y高速多功能粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司產品；5804R高速離心機：德國Eppendorf公司產品；RE-52A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠產品；HH.S11-2電熱恒溫水浴鍋：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司產品；RW20DS025攪拌器：上海翼悾機電有限公司產品；VGA/USB/AV三合一接口CCD顯微鏡：上海韌躍電子科技有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同加工方法提取火麻油

1）冷榨制油 取火麻子1 000 g在60℃烘箱中干燥10 h，冷卻后送入螺桿壓榨機壓榨，設置榨膛溫度為120℃。收集的毛油以5 000 r/min離心10 min，取上清液倒入50 mL離心管，用封口膜封好，保存在4℃冰箱中備用。

2）熱榨制油 取火麻子1 000 g在100℃烘箱中干燥3 h，冷卻后送入螺桿壓榨機壓榨，設置榨膛溫度為120℃。收集的毛油以5 000 r/min離心10 min，取上清液倒入50 mL離心管，用封口膜封好，保存在4℃冰箱中備用。

3）水酶法制油 取火麻子1 000 g在40℃烘箱中干燥12 h，放入粉碎機粉碎。取300 g火麻子粉，按料液比1 g∶5 mL加入蒸餾水并攪拌均勻，調節體系pH為8.5，添加8%（質量分數，以火麻子質量計）Alacalase 2.4 L蛋白酶，放入60℃水浴鍋以135 r/min恒溫攪拌，酶解3 h后升溫至90℃滅酶10 min，冷卻至室溫，8 000 r/min離心30 min，取出上層游離油，置于4℃冰箱保存備用。

4）浸出提油 火麻子在40℃烘箱干燥12 h后，放入粉碎機粉碎，取300 g粉末，加入正己烷（料液比1 g∶5 mL）后，用攪拌儀恒速攪拌過夜，靜置過濾，在旋轉蒸發器中蒸出溶劑，收集油液。

1.2.2 水酶法提油單因素實驗

1）加酶量對火麻油總酚質量分數的影響 在料液比1 g∶5 mL，體系pH 8.5，恒溫60℃攪拌，酶解3 h，90℃滅酶10 min，8 000 r/min離心30 min的條件下，分別考察加酶量為2%、4%、6%、8%（質量分數）時，火麻油中的總酚質量分數。

2）料液比對火麻油總酚質量分數的影響 在加酶量8%（質量分數），體系pH 8.5，恒溫60℃攪拌，酶解3 h，90℃滅酶10 min，8 000 r/min離心30 min的條件下，分別考察料液比為1 g∶3 mL、1 g∶4 mL、1 g∶5 mL、1 g∶6 mL時，火麻油中的總酚質量分數。

3）pH對火麻油總酚質量分數的影響 在加酶量8%（質量分數），料液比為1 g∶5 mL，恒溫60℃攪拌，酶解3 h，90℃滅酶10 min，8 000 r/min離心30 min的條件下，分別考察體系pH為6.5、7.5、8.5、9.5時，火麻油中的總酚質量分數。

1.2.3 響應面實驗設計基于單因素實驗結果，設計主要影響因素的水平取值范圍。采用響應面中心復合實驗，觀察各酶解參數對優化指標的影響規律。以加酶量、料液比、pH為自變量，以火麻油中總酚質量分數為響應值，實驗設計見表1。

1.2.4 火麻油中總酚含量測定用10 mL甲醇和10 mL正己烷活化Diol-SPE柱。在離心管中稱取3.0 g火麻油，加入5 mL正己烷，振蕩1 min使其溶解，沿萃取柱管壁加入后，用10 mL正己烷洗柱，棄去全部淋洗液。用10 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液在氮氣下吹干后加入2.0 mL甲醇復溶，經0.22μm濾膜過濾后置于樣品瓶中[12]。在15 mL離心管中加入1 mL火麻油多酚提取物、0.5 mL福林酚試劑、2 mL質量分數7.5%的碳酸鈉溶液和6.5 mL去離子水，渦旋振蕩2 min混勻。將反應物置于70℃水浴鍋中加熱30 min，溶液將由無色變藍色。在750 nm波長下測定溶液吸光度，通過標準曲線計算火麻油中總酚的質量分數。

表1 響應面實驗設計表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 線蟲實驗線蟲培養基（nematode growth medium，NGM）：3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、17 g瓊脂、25 mL的1 mol/L磷酸鉀緩沖液、975 mL去離子水，121℃滅菌20 min后，加入1 mL的1 mol/L MgSO4溶液、1 mL的1 mol/L CaCl2溶液、1 mL膽固醇溶液（5 mg/mL無水乙醇配制）。

M9緩 沖 液：3 g KH2PO4、15.1 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 mL的1 mol/L MgSO4溶液，加去離子水至1 L，搖勻后121℃滅菌20 min。

5 mg/mL火麻油溶液（4種加工方式制得）：在10 mL離心管中加入40 mg油液和8μL二甲基亞砜，加去離子水至8 mL，渦旋混勻后，使用超聲波細胞破碎儀充分破碎濁液，至不分層為止。

1）線蟲生長同步化 用M9緩沖液將培養基表面的成蟲沖洗至1.5 mL離心管中，離心后棄上清液，再用M9緩沖液清洗兩遍，留500μL緩沖液于離心管內。然后加入500μL的裂解液（M9緩沖液、5 mol/L NaOH溶液、質量分數10%NaClO溶液體積比為7∶2∶1）混勻，用M9洗滌沉淀3次，去除殘存的裂解液，最終得到的沉淀即為蟲卵。

2）運動缺陷模型建立 配制10 mmol/mL H2O2溶液，待蟲卵在M9緩沖液中孵育16 h成長為L1期幼蟲后，轉移到1.5 mL離心管中，6 500 r/min離心2 min后棄上清液，留下500μL的液體，加入H2O2溶液至1 mL，實際的H2O2溶液處理濃度為5 mmol/mL，混勻后在24孔板中浸泡1 h。

3）培養分組 線蟲培養一共分10組，2組培養基不涂油，另外8組培養基分別涂布熱榨油、冷榨油、浸出油和水酶法得油，每種油涂布2個平板，共得到5種處理方式的培養基，每種培養基分別轉入運動缺陷的L1期幼蟲和正常幼蟲。

4）線蟲行為能力測定 頭部擺動頻率測定：在空白的NGM培養基上滴加50μL M9緩沖液，挑取線蟲到緩沖液中，待線蟲在緩沖液中穩定1 min后，用顯微鏡拍攝，錄制視頻，數出線蟲1 min內頭部往返擺動的次數，每組測定20條。身體彎曲頻率測定：挑取線蟲到空白的NGM培養基上，待線蟲恢復穩定1 min后，用顯微鏡拍攝，錄制視頻，20 s內記錄線蟲身體彎曲的次數，每組測定20條。

1.3 數據處理

采用Excel、SPSS 28.0和Design-Expert 8.0對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 水酶法提取火麻油單因素實驗

2.1.1 加酶量對火麻油總酚質量分數的影響在料液比1 g∶5 mL，體系pH 8.5，恒溫60℃攪拌，酶解3 h，8 000 r/min離心30 min的條件下，考察加酶量對火麻油中總酚質量分數的影響，結果見圖1。隨著加酶量的增加，火麻油中總酚質量分數先升高后下降，當加酶量4%（質量分數）時，總酚質量分數明顯高于其他組。隨著酶量增多，酶與底物相互作用，使酶功能進一步發揮，分解油脂顆粒內部的脂蛋白與脂多糖，釋放油脂[6]，進而使得多酚物質充分溶出；當加酶量進一步增加，酶與底物的作用位點逐漸達到飽和，降低了溶出率。故響應面實驗中，加酶量選擇質量分數2%~4%。

圖1 加酶量對火麻油總酚質量分數的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on total phenol content of hemp seed oil

2.1.2 料液比對火麻油總酚質量分數的影響在加酶量8%（質量分數），體系pH 8.5，恒溫60℃攪拌，酶解3 h，8 000 r/min離心30 min的條件下，考察料液比對火麻油中總酚質量分數的影響，結果見圖2。料液比在1 g∶3 mL~1 g∶5 mL時，火麻油中總酚質量分數上升；在1 g∶5 mL~1 g∶6 mL時，總酚質量分數明顯下降。適量的水可促進酶解作用，隨著水分增多，酶反應體系中的酶濃度和底物濃度降低，分子碰撞概率減小，酶作用效果降低，使酚類物質難以溶出[13]；水量過少時，料液黏度較大，酶與底物流動受到阻滯，油中的物質難以分解出來。因此，響應面實驗設計中，料液比選擇1 g∶4 mL~1 g∶6 mL。

圖2 料液比對火麻油總酚質量分數的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on total phenol mass fraction of hemp seed oil

2.1.3 pH對火麻油總酚質量分數的影響在加酶量8%（質量分數），料液比為1 g∶5 mL，恒溫60℃攪拌，酶解3 h，8 000 r/min離心30 min的條件下，考察體系pH對火麻油中總酚質量分數的影響，結果見圖3。隨著體系pH增加，火麻油中總酚質量分數先上升后下降，在pH 8.5附近出現最大值。Alacalase 2.4 L蛋白酶的最適pH為8.5，此時酶的水解作用最佳，得到的活性物質含量最高。因此，響應面實驗中，選擇pH為7.5~9.5。

圖3 pH對火麻油總酚質量分數的影響Fig.3 Effect of pH on total phenol content of hemp seed oil

2.2 響應面實驗結果分析

在單因素實驗基礎上，選取加酶量（X1）、料液比（X2）、pH（X3）為自變量，火麻油中總酚質量分數為響應值，進行響應面實驗，結果見表2。通過軟件Design-Expert 8.0對表2的數據進行回歸分析，得到的回歸方程為：

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知，模型F為9.27，P<0.05（差異顯著），自變量與響應值之間有顯著的線性關系，模型選擇合適。該模型R2=0.965 3，R2Adj=0.861 2，說明模型與實驗擬合性較好。實驗的變異系數為5.80%，模型置信度較好，說明該方程能很好地反映實驗值的真實性。各因素對火麻油總酚質量分數的影響大小為：X1>X3>X2，即加酶量>pH>料液比。

加酶量與料液比、加酶量與酶解pH、料液比與酶解pH的交互作用對火麻油中總酚質量分數的影響見圖4。利用Design-Expert軟件對模型進一步分析，得到最優響應結果：加酶量為4.57%（質量分數），料液比為1 g∶4.79 mL，pH為8.24，在此條件下，火麻油中總酚的理論預測值為67.29 mg/kg。

在響應面分析法求得的最佳條件下，進行3次平行實驗，測得火麻油中總酚的3次平均值為65.78 mg/kg，與理論值差距較小，說明實驗結果與回歸方程的預測值吻合性較好。

表3 回歸方程與方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

圖4 各因素的交互作用對火麻油總酚質量分數的影響Fig.4 Response surface plots for the interactive effects of different hydrolysis parameters on the total phenol content of hemp seed oil

2.3 火麻油對線蟲行為能力的影響

線蟲的運動行為能力主要包括頭部擺動頻率和身體彎曲頻率，運動頻率越高，能量消耗越多，機體代謝加速，會使脂質積累的程度降低[1，14]。實驗采用5 mmol/mL的H2O2溶液處理裂解后同步生長到L1期的幼蟲，建立運動缺陷模型，分別用4種加工方式處理的火麻油喂養，探究對線蟲行為能力的影響。培養實驗設計分組見表4。

由圖5可知，對比4種不同加工方式處理后的火麻油可以發現，水酶法和熱榨法制油能夠保持較高的總酚質量分數，且明顯高于其他兩組油樣，冷榨法油樣次之，浸出法油樣最低；制備的油樣中，水酶法和浸出法得油色澤較淺，冷榨油顏色較深，熱榨油最深。

火麻油及其活性成分可以提高大腦組織中多種酶的活性，增加大腦組織的總抗氧化能力，降低神經細胞膜的脂質過氧化水平，保護細胞膜和腦組織形態的完整性，增強神經系統的功能[1，4]。由圖6可知，H2O2處理組線蟲的行為能力都比正常線蟲低一些。添加火麻油之后，由于油中活性物質的影響，可以改善線蟲的行為能力，改善效果依次為：水酶法>熱榨法>冷榨法>浸出法。根據不同加工方式下火麻油總酚質量分數測定結果可以得出，火麻油中的多酚活性物質確實可以改善線蟲的行為能力，即使是經過H2O2處理的運動缺陷型線蟲，受到油液中活性物質的作用之后，其頭部擺動頻率和身體彎曲頻率也有所提高，可見線蟲受到了油及其活性成分的影響，行為能力得到了改善。

表4 線蟲培養實驗分組Table 4 Different experimental groups for C.elegans culture

3 結語

選用Alacalase 2.4 L蛋白酶對火麻子水解，利用響應面法進行優化，得到水酶法提油最佳工藝條件：加酶量為4.57%（質量分數），料液比為1 g∶4.79 mL，pH為8.24，在此條件下，火麻油中總酚為65.78 mg/kg。由F檢驗可得各因素對火麻油總酚質量分數的貢獻順序為：X1>X3>X2，即加酶量>pH>料液比。火麻油中的多酚物質可以改善線蟲的運動行為能力。不同加工方式處理的火麻油總酚質量分數依次為：水酶法>熱榨法>冷榨法>浸出法。受到火麻油中活性成分的影響，線蟲行為能力的改善效果也不同，其順序為：水酶法>熱榨法>冷榨法>浸出法。

圖5 不同加工方式下火麻油的總酚質量分數Fig.5 Total phenol content of different processed hemp seed oils

圖6 不同加工方式下火麻油對線蟲行為能力的影響Fig.6 Effects of different processing hemp seed oils on the motor behavior of C.elegans