脂質(zhì)體外消化過程中氧化評(píng)價(jià)模型與檢測方法研究進(jìn)展

張銘凱，李曉雯，孟 晨，陳亞淑，陳洪建，鄧乾春*

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430048；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料作物研究所，湖北 武漢 430062；3.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

作為人體三大必需營養(yǎng)素之一，脂質(zhì)提供了機(jī)體運(yùn)作所需要的能量以及必需脂肪酸等生物活性物質(zhì)[1]。95%的脂質(zhì)在食品中以甘油三酯的形式存在，甘油三酯中不同的脂肪酸組成讓脂質(zhì)呈現(xiàn)不同的特性。

脂質(zhì)作為日常食品的重要組成部分，不僅在提取、加工、運(yùn)輸過程中容易發(fā)生氧化，當(dāng)脂質(zhì)進(jìn)入人體消化道時(shí)，體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境存在眾多因素促使脂質(zhì)發(fā)生氧化，形成脂質(zhì)氫過氧化物、揮發(fā)性不飽和醛等氧化產(chǎn)物[2]。這些氧化產(chǎn)物的生成不僅降低了脂質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[3]，過量攝入還會(huì)增加患心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。然而，由于食物基質(zhì)與胃腸道環(huán)境的復(fù)雜性，脂質(zhì)在消化中的氧化程度受到消化道內(nèi)的多種環(huán)境因素影響，共同消化的食品組分也會(huì)改變脂質(zhì)的氧化速率，導(dǎo)致脂質(zhì)在消化中的氧化狀態(tài)難以監(jiān)控。

為了更好地研究脂質(zhì)在人體內(nèi)消化過程中的酶解、氧化情況，體外消化模型是最常用的方法。目前靜態(tài)、半動(dòng)態(tài)和動(dòng)態(tài)消化模型在脂質(zhì)消化吸收方面已得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)，為了評(píng)估脂質(zhì)在消化后的狀態(tài)，對(duì)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的檢測方法也隨著研究人員的開發(fā)不斷更新，準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度等特性都在不斷提高。作者通過總結(jié)體外消化模型和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物檢測方法在脂質(zhì)氧化機(jī)理研究中的發(fā)展以及應(yīng)用現(xiàn)狀，以求為今后的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 消化過程中脂質(zhì)氧化的研究現(xiàn)狀

1.1 脂質(zhì)消化過程及其對(duì)脂質(zhì)氧化的影響

脂類進(jìn)入人體消化道會(huì)經(jīng)過乳化、水解、吸收3個(gè)階段。在口腔中，咀嚼作用使食物分解成較小的顆粒，讓脂質(zhì)在胃部更快地接觸脂肪酶從而分解、乳化。而最主要的脂質(zhì)消化吸收階段在小腸，通過腸道內(nèi)的促消化因子讓脂質(zhì)分解形成乳糜微粒，從而被腸道吸收。

1.1.1 口腔消化階段雖然脂質(zhì)在口腔中停留時(shí)間不長，但口腔仍能對(duì)不同狀態(tài)食物中的脂質(zhì)造成不同程度的影響。液體、固體兩種狀態(tài)的食物在口腔消化階段的分解效果不同，從而影響到包含在其中的脂質(zhì)的消化效果。液體通常在口腔中停留時(shí)間很短，但其所含的脂質(zhì)會(huì)和唾液中的礦物質(zhì)、黏蛋白、酶等物質(zhì)相互作用而使脂質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生變化[3]。黏蛋白能夠包裹或者吸附脂質(zhì)液滴，礦物質(zhì)離子可以通過離子結(jié)合效應(yīng)和靜電屏蔽效應(yīng)讓脂質(zhì)液滴聚集。而半固體或固體的食物在口腔中停留時(shí)間相對(duì)更久，咀嚼使得固體食物被機(jī)械分解成小顆粒，增加脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)與胃腸道接觸的面積。在口腔消化階段，脂質(zhì)與促氧化因子的接觸較少，脂質(zhì)的乳化作用也還沒有開始，脂質(zhì)的氧化程度較低。

1.1.2 胃消化階段在脂質(zhì)消化過程中，胃部的作用主要是對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行初步乳化和儲(chǔ)存[5]。脂質(zhì)的乳化作用在胃中開始，通過胃的機(jī)械力和胃中的強(qiáng)酸、消化酶等介質(zhì)幫助處于不同食物基質(zhì)中的脂質(zhì)釋放出來，產(chǎn)生一定量的油水界面從而乳化脂質(zhì)。脂質(zhì)在胃腸道中被逐步分解成甘油二?；?、甘油單?；?、磷脂、甾醇、游離脂肪酸等形式[6]，這些分解產(chǎn)物中的少部分會(huì)通過被動(dòng)擴(kuò)散被胃黏膜吸收[7]。在這個(gè)過程中，無論在胃中的脂質(zhì)性質(zhì)如何，其甘油三酯中的sn-3位都能被胃脂肪酶特異性水解[8]。經(jīng)過初步乳化的脂質(zhì)所形成的1，2-二?；视秃陀坞x脂肪酸等物質(zhì)能進(jìn)一步促進(jìn)脂肪酶和甘油三酯的結(jié)合，使得脂質(zhì)液滴的粒徑大小被改變，同時(shí)對(duì)胃中脂肪酶的活性產(chǎn)生影響。通過胃部的消化作用，食品中脂質(zhì)的界面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變，再通過胃的排空作用將食糜運(yùn)輸?shù)侥c道。

由于脂質(zhì)液滴粒徑大小不同，脂質(zhì)在正常成年人胃中分解程度差異較大（一般在5%~37%），其對(duì)胃中氧氣、金屬離子等促氧化因子敏感性也不同。通過胃部的消化作用，部分脂質(zhì)被分解成更易發(fā)生氧化反應(yīng)的游離脂肪酸形式，在胃中氧氣、其他食品組分等多重因素的影響下生成氫過氧化物等氧化產(chǎn)物（見圖1）[9]。在給哥廷根小型豬喂食含有葵花籽油的高脂高蛋白飼料之后，Gobert等在不同時(shí)間段對(duì)豬胃部消化液進(jìn)行取樣，對(duì)比發(fā)現(xiàn)進(jìn)食后期消化液中硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）含量明顯高于前期，說明在胃中脂質(zhì)氧化程度明顯增加[10]。并且胃內(nèi)部環(huán)境含有多種促氧化因素，尤其是金屬離子。Larsson等在體外模擬消化實(shí)驗(yàn)中加入血紅蛋白模擬胃部含鐵離子環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在胃消化階段結(jié)束后，消化液TBARS值上升，并且通過不同狀態(tài)（37℃環(huán)境、有無脂肪酶）的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TBARS值增加的程度明顯減弱，說明胃部本身的促氧化環(huán)境是脂質(zhì)氧化的主導(dǎo)因素[11]。同時(shí)，在胃消化階段，氫過氧化物的含量遠(yuǎn)大于TBARS含量，而腸道消化階段后TBARS值再次升高，表明脂質(zhì)在胃消化階段中的氧化反應(yīng)主要形成的是初步氧化產(chǎn)物。

圖1 以亞油酸為例的氫過氧化物形成流程圖Fig.1 Hydroperoxide formation flow chart with linoleic acid as an example

1.1.3 腸消化階段對(duì)比脂質(zhì)在胃部的消化，小腸部分對(duì)脂質(zhì)的消化吸收貢獻(xiàn)更大。脂質(zhì)在小腸中經(jīng)胰脂肪酶、羧基酯脂肪酶、膽鹽刺激脂肪酶等共同作用下發(fā)生脂質(zhì)水解反應(yīng)，其中胰脂肪酶對(duì)甘油三酯水解作用占到甘油三酯在人體總水解程度的45%~70%[12]。當(dāng)脂質(zhì)進(jìn)入十二指腸的時(shí)候，小腸會(huì)迅速分泌膽汁和胰液，其中大量的膽汁鹽、磷脂酰膽堿、游離膽固醇等會(huì)與脂質(zhì)混合。此時(shí)，低濃度的膽汁鹽能夠促進(jìn)胰脂肪酶水解脂質(zhì)，但高濃度的膽汁鹽會(huì)抑制胰脂肪酶的活性。同時(shí)輔脂酶能夠調(diào)控胰脂肪酶的水解速率，胰脂肪酶必須在輔脂酶的幫助下才能從甘油三酯中水解出脂肪酸。有了胰脂肪酶、膽汁鹽、輔脂酶等調(diào)控因子的存在，才能保證脂質(zhì)高效穩(wěn)定地被水解。通過胰脂肪酶的作用，脂質(zhì)會(huì)被水解成2-單酰基甘油和脂肪酸，這些脂質(zhì)水解產(chǎn)物會(huì)在膽汁鹽的存在下自發(fā)合成乳糜微粒，同時(shí)磷脂和2-單?；视蜁?huì)促進(jìn)乳糜微粒的合成，提升脂質(zhì)的吸收速率[13]。脂質(zhì)在腸道內(nèi)分解后生成的游離脂肪酸、膽固醇、卵磷脂等物質(zhì)會(huì)被小腸上皮細(xì)胞吸收。其中短、中鏈脂肪酸會(huì)直接進(jìn)入血液循環(huán)，長鏈脂肪酸會(huì)在吸收后重新被合成為甘油三酯，通過與膽固醇、蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合形成乳糜微粒，最終進(jìn)入血液循環(huán)，運(yùn)輸?shù)饺梭w各個(gè)器官中提供能量[14]。

脂質(zhì)經(jīng)過胃部初步分解、乳化后更容易和腸道內(nèi)的消化酶以及促氧化因子作用，也就更容易發(fā)生氧化反應(yīng)。腸道內(nèi)的胰脂肪酶會(huì)優(yōu)先水解粒徑很小的乳化油脂，阻礙油脂液滴發(fā)生像胃部環(huán)境中的聚集現(xiàn)象，從而使得腸道消化中的脂質(zhì)氧化反應(yīng)速率比胃部消化階段更快。通過在恒溫?fù)u床上模擬腸道消化新鮮的魚肝油，Larsson等發(fā)現(xiàn)模擬腸道消化后的消化液中TBARS含量顯著上升[15]。

目前，單獨(dú)對(duì)腸道中脂質(zhì)分解、氧化機(jī)理的研究并不多。這是因?yàn)槟c道中對(duì)脂質(zhì)氧化狀態(tài)造成影響的因素相對(duì)于口腔、胃部更復(fù)雜，并且更難以檢測各個(gè)因素具體的影響效果[16]。為了充分了解脂質(zhì)在消化中的氧化狀態(tài)變化及其對(duì)人體的影響，越來越多的學(xué)者開展對(duì)脂質(zhì)消化過程的研究?？紤]到體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)的道德倫理約束以及高成本的耗材，搭建或使用體外消化模型研究脂質(zhì)消化過程中的氧化成為主要評(píng)價(jià)方法之一。

1.2 消化過程中脂質(zhì)氧化的靜態(tài)消化模型研究現(xiàn)狀

體外消化模型是近二十年的研究熱點(diǎn)[17]，與體內(nèi)消化相比，體外消化能夠降低研究成本、節(jié)省時(shí)間和人工、同時(shí)提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性[18]。目前，靜態(tài)體外消化方法是人體消化脂質(zhì)過程研究中應(yīng)用最廣泛的方法。

靜態(tài)INFOGEST模型[19]在2014年發(fā)表，眾多研究人員以此模型研究脂質(zhì)的消化、氧化過程。由于不同參數(shù)的靜態(tài)消化模型對(duì)于脂質(zhì)消化過程的呈現(xiàn)性有著明顯差異，INFOGEST模型將靜態(tài)體外消化模型的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，使得使用此模型的各種實(shí)驗(yàn)有了對(duì)比性。之后，在2019年研究者接著發(fā)表了優(yōu)化后的靜態(tài)INFOGEST 2.0模型（見圖2）[20]。對(duì)比2014版的INFOGEST模型，最大的變化在于利用了兔胃脂肪酶（RGE）來模擬人胃脂肪酶。人胃脂肪酶對(duì)脂質(zhì)消化的促進(jìn)作用能改變脂質(zhì)在胃中以及進(jìn)入腸道時(shí)的狀態(tài)，影響后續(xù)腸道內(nèi)消化酶對(duì)脂質(zhì)的作用效果[21]，以及脂質(zhì)的氧化穩(wěn)定性。RGE與人胃脂肪酶的序列同源性達(dá)到了85%[22]，且與人胃脂肪酶有類似的pH敏感性。

INFOGEST 2.0模型完善了靜態(tài)體外消化模型的口、胃、腸消化液參數(shù)以及確切的組分混合配比和添加流程，學(xué)者可根據(jù)自己的需求在不同的消化階段取樣進(jìn)行分析研究。利用添加了消化酶的靜態(tài)模型，更利于食物中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分在胃腸道中釋放出來，從而觀測不同消化階段中食品組分對(duì)脂質(zhì)氧化狀態(tài)的影響。Steppeler等以牛肉、豬肉、雞肉、鮭魚肉等血紅素含量不同的肉為原料，利用INFOGEST消化模型進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn)來探討攝入的肉（牛、羊、豬肉等）與結(jié)腸直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性[23]。同樣，INFOGEST模型也可以作為基礎(chǔ)模型來對(duì)比人體和其他動(dòng)物的消化過程，從而探究不同因素對(duì)脂質(zhì)氧化的影響。Tullberg等為了探究魚肝油在消化過程中的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物（HNE、MDA等）形成情況，以INFOGEST模型為原型設(shè)定了運(yùn)用豬消化道中酶、膽鹽和人體腸液的3種不同靜態(tài)消化模型，發(fā)現(xiàn)在3種模型的消化過程中胃部的MDA、HNE含量均有增加且在腸消化階段后這些產(chǎn)物的含量再次上升，并且添加人體腸液的實(shí)驗(yàn)組消化液中氧化產(chǎn)物含量多于其他模型[24]。以上結(jié)合靜態(tài)消化模型探究多種因素對(duì)不同類型的脂質(zhì)氧化影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)未來學(xué)者設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究消化中脂質(zhì)氧化的機(jī)理有著重要指導(dǎo)作用。

圖2 INFOGEST 2.0模型模擬消化流程Fig.2 INFOGEST 2.0 model simulates the digestion process

目前多數(shù)脂質(zhì)消化研究將靜態(tài)體外消化作為結(jié)果評(píng)估的重要環(huán)節(jié)之一，但靜態(tài)消化本身無法避免地需要在恒溫水浴鍋或者恒溫?fù)u床中進(jìn)行手動(dòng)操作，從而形成誤差。并且，靜態(tài)INFOGEST模型僅適用于胃、腸端點(diǎn)取樣，也無法模擬脂質(zhì)攝入時(shí)消化酶濃度動(dòng)態(tài)變化、pH變化、機(jī)械剪切作用、胃腸道排空作用等動(dòng)態(tài)因素。尤其是靜態(tài)模型無法模擬pH以及消化酶含量的動(dòng)態(tài)變化，使得胃腸道中多數(shù)促氧化因子對(duì)脂質(zhì)氧化狀態(tài)的影響無法真實(shí)還原。這樣的局限性讓靜態(tài)體外消化模型不能很準(zhǔn)確地模擬復(fù)雜的體內(nèi)消化條件。為了能更深入了解脂質(zhì)在消化中的狀態(tài)變化，動(dòng)態(tài)體外模擬消化技術(shù)必不可少。

1.3 消化過程中脂質(zhì)氧化的半動(dòng)態(tài)和動(dòng)態(tài)消化模型研究現(xiàn)狀

消化模型若涉及模型參數(shù)實(shí)時(shí)變化、消化道機(jī)械力模擬等動(dòng)態(tài)模擬技術(shù)，常常被分為半動(dòng)態(tài)消化模型和動(dòng)態(tài)消化模型。表1列出了近年來運(yùn)用了半動(dòng)態(tài)、動(dòng)態(tài)消化模型研究脂質(zhì)消化相關(guān)課題的實(shí)例。

體外消化脂質(zhì)過程中共消化食物組分的差異、模擬消化酶的不同來源、胃部本身的剪切及排空過程等多種因素均影響脂質(zhì)的氧化程度、乳糜微粒形成和脂肪酸的釋放，應(yīng)用半動(dòng)態(tài)消化模型能夠研究脂質(zhì)消化過程中脂質(zhì)反應(yīng)的一些前提條件。半動(dòng)態(tài)消化模型是介于簡單的靜態(tài)消化模型和復(fù)雜的動(dòng)態(tài)消化模型之間的一種模型，通常研究口腔、胃和小腸的單一消化階段，通過加入注射泵、pH-stat、恒溫?cái)嚢?振蕩器等設(shè)備模擬消化道中酶的釋放、pH動(dòng)態(tài)變化等特性[25]。尤其是pH-stat方法，能夠?qū)⒌味▋x器與計(jì)算機(jī)聯(lián)合使用，自動(dòng)化控制消化模型中的pH。同時(shí)，pH-stat方法簡單、實(shí)用，能夠?qū)崟r(shí)觀察消化道pH梯度曲線。有研究者運(yùn)用類似半動(dòng)態(tài)模擬胃部消化模型研究不同食品基質(zhì)對(duì)胃部消化時(shí)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)水解程度的影響[26]。然而此研究中僅模擬胃部消化過程，忽略了口腔消化中黏蛋白、酶、消化液等對(duì)食物中脂質(zhì)消化狀態(tài)的影響。隨后，該研究者在全脂牛奶的模擬消化過程中，采用了靜態(tài)模擬口腔消化后的樣品作為半動(dòng)態(tài)模擬胃部消化的初始樣品，更加貼近真實(shí)的消化流程[27]。胃部消化過程中，由于pH降低會(huì)影響胃部脂肪酶、蛋白酶等活性，進(jìn)而改變脂質(zhì)分解的脂肪酸進(jìn)入小腸的時(shí)間，延遲胃的排空作用[28]，從而影響脂質(zhì)消化及氧化的進(jìn)程?？梢酝ㄟ^在胃消化的不同時(shí)間段運(yùn)用注射器抽取消化模型容器中的樣品，以模擬胃消化脂質(zhì)時(shí)的排空行為[29]。同時(shí)，半動(dòng)態(tài)消化模型中動(dòng)態(tài)變化的酶含量更利于觀察消化道中的消化酶對(duì)脂質(zhì)分解及氧化進(jìn)程的影響[30]。

基于以上研究，同時(shí)參考INFOGEST靜態(tài)消化模型，有研究者設(shè)計(jì)了一種模擬成人上消化道的半動(dòng)態(tài)INFOGEST體外消化標(biāo)準(zhǔn)模型，大大提高了運(yùn)用半動(dòng)態(tài)消化模型進(jìn)行脂質(zhì)消化實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性[31]。模型中加入pH逐漸降低、胃液分泌和胃排空等胃部消化階段中的動(dòng)態(tài)行為，填補(bǔ)了INFOGEST模型在模擬消化過程中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。半動(dòng)態(tài)消化模型改善了靜態(tài)模型只能從胃腸道端點(diǎn)取樣的特點(diǎn)，能更好地研究脂質(zhì)分解、氧化以及吸收過程。其相對(duì)簡單的實(shí)驗(yàn)流程便于學(xué)者根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)半動(dòng)態(tài)消化模型進(jìn)行優(yōu)化。但目前大多數(shù)半動(dòng)態(tài)消化模型選用的簡單的圓柱形容器，無法模擬胃內(nèi)真實(shí)的J型結(jié)構(gòu)和機(jī)械剪切作用。同時(shí)，除開胃部蠕動(dòng)的機(jī)械作用，半動(dòng)態(tài)消化模型對(duì)其他胃動(dòng)力行為的模擬通常是運(yùn)用磁力攪拌、恒溫振蕩器等設(shè)備，可能會(huì)破壞食品的結(jié)構(gòu)從而與體內(nèi)真實(shí)消化情況產(chǎn)生偏差[32]。為了更全面、成體系地研究脂質(zhì)的消化、氧化過程，復(fù)雜且全面的動(dòng)態(tài)消化模型會(huì)是首選。

動(dòng)態(tài)消化模型與靜態(tài)消化模型、半動(dòng)態(tài)消化模型相比，能夠更準(zhǔn)確模擬胃腸道的蠕動(dòng)與排空、食糜的運(yùn)輸、pH與酶濃度的動(dòng)態(tài)變化等動(dòng)態(tài)特征，同時(shí)也能連接不同的消化階段，為脂質(zhì)消化、吸收等機(jī)制的研究提供更有意義的數(shù)據(jù)[33-34]。通常動(dòng)態(tài)消化模型被分為單隔室和多隔室兩種模型。單隔室動(dòng)態(tài)消化模型一般是模擬胃部消化，比如人體胃模擬器（HGS）。設(shè)計(jì)HGS的目的主要是為了模擬消化時(shí)胃竇的蠕動(dòng)，其胃室是由乳膠制成的倒圓錐形容器，內(nèi)部有一個(gè)網(wǎng)袋來模擬胃篩分作用[35]，分別由兩個(gè)機(jī)械泵負(fù)責(zé)模擬胃液的運(yùn)輸和胃排空效應(yīng)，同時(shí)設(shè)定滾輪的壓縮幅度來還原胃部的蠕動(dòng)作用[36]。乳狀液對(duì)消化環(huán)境的剪切作用以及pH變化很敏感，胃部的篩分、蠕動(dòng)以及排空作用能很大程度影響乳液中脂質(zhì)與脂肪酶、活性氧等物質(zhì)的接觸時(shí)間與面積。同時(shí)，HGS中動(dòng)態(tài)變化的參數(shù)會(huì)使乳液在消化中的絮凝現(xiàn)象更嚴(yán)重也更貼合真實(shí)消化過程，較大程度的絮凝會(huì)延緩脂質(zhì)進(jìn)入腸道的時(shí)間，從而調(diào)控脂質(zhì)在腸道消化中的氧化、吸收效果。Ye等采用HGS模型對(duì)比有無熱處理對(duì)乳狀液在體外模擬消化中絮凝狀態(tài)的影響，與半動(dòng)態(tài)消化模型所提供的數(shù)據(jù)相比，HGS模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更真實(shí)地體現(xiàn)了乳狀液在胃部的形態(tài)變化情況，為后續(xù)研究脂質(zhì)在消化道的氧化、吸收過程建立了理論基礎(chǔ)[37]。脂質(zhì)在胃腸道消化過程中，胃中的剪切作用能夠增加脂質(zhì)同胃部促氧化因子（低pH、活性氮族、羥基等）的接觸面積（尤其是固體食品中的脂質(zhì)），增加脂質(zhì)氧化的概率，影響脂質(zhì)在胃腸道中的氧化穩(wěn)定性。HGS的應(yīng)用能夠更真實(shí)地模擬脂質(zhì)在胃消化過程中的氧化環(huán)境。類似HGS的單隔室體外消化模型，為了發(fā)揮耗時(shí)短、重現(xiàn)性強(qiáng)等優(yōu)勢，需要更集中于還原單個(gè)消化階段才能更有針對(duì)性地應(yīng)用于脂質(zhì)消化實(shí)驗(yàn)。

大部分脂質(zhì)水解發(fā)生在小腸消化過程中，游離脂肪酸相對(duì)甘油三酯更容易發(fā)生氧化反應(yīng)，并且脂質(zhì)在胃部發(fā)生氧化反應(yīng)生成的氧化產(chǎn)物會(huì)降低脂質(zhì)在小腸階段的氧化穩(wěn)定性，因此小腸階段的消化、氧化不容忽視，能夠體現(xiàn)人體消化道連續(xù)消化過程的多隔室動(dòng)態(tài)消化模型自然更適合研究脂質(zhì)在消化中的分解、氧化等反應(yīng)。最常用的連續(xù)動(dòng)態(tài)消化模型是TNO胃腸模型（TIM-1）。TIM-1是一個(gè)4隔室（胃、十二指腸、空腸、回腸）消化模型，每個(gè)隔室的消化條件，如消化液分泌速率、pH和酶濃度改變速率等參數(shù)都是通過軟件分別控制蠕動(dòng)泵來調(diào)節(jié)，整個(gè)系統(tǒng)也是處于37℃的水中，通過蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)各隔室之間食糜和消化液的運(yùn)輸，通過泵的周期擠壓來模擬胃腸道的蠕動(dòng)效果，同時(shí)隔室以膜透析食物來模擬小腸的吸收。此模型的設(shè)計(jì)目的是為了模擬系統(tǒng)的人體胃腸道消化過程以及探索各種食品組分的生物可及性[38]。TIM-1是TIM模型中最常用的配置。隨著時(shí)代發(fā)展，推出了TIM-1的簡化版Tiny-TIM模型、針對(duì)研究大腸消化的TIM-2模型以及針對(duì)研究胃中食物均質(zhì)和排空作用的TIMagc模型。從表1可以看出，有很多學(xué)者利用此模型研究脂質(zhì)消化、氧化過程。脂質(zhì)吸收過程會(huì)一直持續(xù)到回腸，TIM-1模型的多隔室設(shè)計(jì)利于研究者對(duì)腸道消化中脂質(zhì)狀態(tài)變化進(jìn)行整體觀察。同時(shí)，TIM-1模型連續(xù)、多隔室的特點(diǎn)更利于表現(xiàn)出共消化食品組分以及胃腸道中促氧化因子對(duì)脂質(zhì)氧化狀態(tài)的影響。基于以上特點(diǎn)，Maestre等以TIM-1為消化模型觀測了葡萄籽多酚對(duì)腸道中脂質(zhì)氧化的限制作用以及高脂肪含量的魚肉在消化中脂質(zhì)氧化的情況[39]。作為TIM-1模型的簡化版，Tiny-TIM則是針對(duì)TIM-1模型流量有限制的專項(xiàng)優(yōu)化模型，在不舍棄模擬消化階段連貫性的同時(shí)提高了消化物的通量，也減少了實(shí)驗(yàn)耗時(shí)。利用Tiny-TIM模型，Larsson等先后研究了脂肪含量以及血紅蛋白對(duì)體外消化中脂質(zhì)氧化的影響和魚肝油在體外模擬消化中的氧化程度變化[40-41]?？梢钥闯觯琓IM系列體外動(dòng)態(tài)消化模型各有自身的側(cè)重點(diǎn)，利于學(xué)者針對(duì)不同探究目的選擇不同模型。不僅僅是TIM模型，所有的靜態(tài)、半動(dòng)態(tài)以及動(dòng)態(tài)消化模型都還在不斷優(yōu)化中，從而使目的不同的體外消化實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋诱鎸?shí)、準(zhǔn)確地模擬人體中脂質(zhì)的消化、氧化過程。

表1 半動(dòng)態(tài)和動(dòng)態(tài)體外消化模型研究脂質(zhì)消化的實(shí)例Table 1 Examples of semi-dynamic and dynamic in vitro digestion models for studying lipid digestion

2 脂質(zhì)消化后的氧化狀態(tài)評(píng)價(jià)

2.1 常用脂質(zhì)氧化產(chǎn)物檢測方法

多年來，研究人員探索出眾多檢測脂質(zhì)氧化狀態(tài)的方法（見表2）。例如，以過氧化值為目標(biāo)值的碘量滴定法、檢測過氧化氫的二甲酚橙測定法（FOX測定法）和硫氰酸鐵法、以紫外分光光度法測定含有共軛二烯（CD）/共軛三烯（CT）樣品的吸光度和TBARS法等。由于快捷方便、成本低等特點(diǎn)，這些方法至今仍是最常用的檢測方法。但消化后的食品各組分狀態(tài)造成體系復(fù)雜，導(dǎo)致以上對(duì)單一目標(biāo)物檢測的方法準(zhǔn)確性和特異性都有待考量[42]。

表2 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的常用檢測方法Table 2 Common detection methods of oxidation products of lipids

以測定MDA含量的TBARS法為例，這種方法簡單而且重復(fù)性高，廣泛應(yīng)用于豬肉、牛羊肉、香腸等食物中的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物檢測。但由于在TBARS法中所檢測的MDA-TBA2和硫代巴比妥酸（TBA）與糖、多肽等其他化合物結(jié)合形成的物質(zhì)具有相同的波長，或者食品基質(zhì)中含有吸收此波長的物質(zhì)，都會(huì)使得TBARS法測定值不準(zhǔn)[43]。基于TBARS法，欒君等通過UPLC-FLD法和UPLC-DAD法對(duì)MDA-TBA2進(jìn)行定量分析，并且可以將結(jié)果和原TBARS法對(duì)比來優(yōu)化UPLC方法[44]。在HNE的檢測中，分光光度法和LC-MS技術(shù)是很常見的檢測方法。為了提高這些方法的精密度和準(zhǔn)確性，可以在樣品中加入醛反應(yīng)探針，利用醛的固有反應(yīng)讓樣品中的醛轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的狀態(tài)。在這些方法中，常用2，4-二硝基苯肼（DNPH）作為醛反應(yīng)探針[45-47]與HNE反應(yīng)生成二硝基苯腙化合物，利于通過高效液相色譜技術(shù)檢測其含量。之后，Wang等選取了2-肼喹啉（HQ）代替DNPH和HNE進(jìn)行反應(yīng)，新的衍生物能提高LC-MS/MS方法對(duì)HNE含量檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[48]。

大多數(shù)的分析方法運(yùn)用了高效液相色譜、質(zhì)譜、氣相色譜以及多種分析方法聯(lián)用等技術(shù)，這些技術(shù)在不同程度上改善了傳統(tǒng)方法特異性差的缺點(diǎn)，但需要大量的溶劑。同時(shí)，方法中的眾多衍生化實(shí)驗(yàn)步驟使得實(shí)驗(yàn)誤差增大。考慮到這些情況，氣相/固相微萃取法和核磁共振波譜法（1H-NMR）開始被研究人員運(yùn)用在脂質(zhì)氧化產(chǎn)物檢測中。氣體擴(kuò)散微萃?。℅DME）方法利用氣相中的分析物通過多孔膜擴(kuò)散和微萃取的原理[49]，尤其適用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的檢測[50-51]。隨后，該研究者結(jié)合了分散液相微萃取（DLLME）和GDME技術(shù)，利用DLLME能夠減少溶劑消耗和GDME能同時(shí)衍生與萃取等特點(diǎn)，建立了新型的GDME-DLLME方法，能同時(shí)在脂質(zhì)中提取MDA、甲醛、乙醛、丙醛、戊醛和丙烯醛這6種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物并進(jìn)行衍生化[65]。相比于降低消耗和誤差的微萃取方法，1H-NMR方法能在樣品無化學(xué)反應(yīng)修飾的情況下同時(shí)檢測CD、氫過氧化物、不飽和醛等多種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物。并且，由于1H-NMR技術(shù)能夠檢測出脂質(zhì)中不同組分所占的比例，通過觀測?；?、脂肪酸等物質(zhì)的比例變化就可以定性、定量的檢測氧化產(chǎn)物以及具有抗氧化活性的親脂性化合物[52]。但由于1H-NMR方法的靈敏度較低，研究消化過程中的脂質(zhì)氧化狀態(tài)常用的是氣相/固相微萃取方法。除了1H-NMR、GDME等檢測方法外，電子自旋共振波譜（ESR）等高靈敏度檢測方法也被用于脂質(zhì)在胃腸道消化過程中氧化自由基的檢測。通過反磁性分子及電子標(biāo)記物的添加，電子捕獲劑同乳糜兩相中生成的氧化自由基及電子標(biāo)記物同中間層的膽鹽等相互作用，來反應(yīng)胃腸道消化中氧化自由基在乳糜中的分布及空間結(jié)構(gòu)變化，精確定位胃腸道中脂質(zhì)氧化反應(yīng)位點(diǎn)。相比于前文提到的常用方法，ESR能夠避免大量試劑的消耗以及衍生化反應(yīng)帶來的誤差。

2.2 特征脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的研究現(xiàn)狀

同時(shí)，探索新的特征脂質(zhì)氧化產(chǎn)物也是提升脂質(zhì)氧化狀態(tài)檢測準(zhǔn)確度的重要研究方向。海洋脂質(zhì)相比于其他食用脂質(zhì)，有著更高含量的不飽和脂肪酸，同時(shí)也更容易發(fā)生氧化。由于更復(fù)雜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，海洋脂質(zhì)的氧化反應(yīng)是一種復(fù)雜的連鎖反應(yīng)，其產(chǎn)物難以監(jiān)測。4-氧-2-壬烯醛（ONE）在海洋脂質(zhì)氧化產(chǎn)物中更具有特征性，Tullberg等在進(jìn)行體外消化中海洋脂質(zhì)氧化狀態(tài)的研究時(shí)選擇了ONE作為新的海洋脂質(zhì)氧化標(biāo)志物，提高了檢測海洋脂質(zhì)氧化程度的特異性和準(zhǔn)確性，減少雜質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果的影響[53]。在探究脂質(zhì)氧化產(chǎn)物時(shí)，大多數(shù)學(xué)者的目光都放在氫過氧化物、α，β-不飽和醛等物質(zhì)上，Grüneis等則提出需要關(guān)注環(huán)氧化物在脂質(zhì)氧化反應(yīng)中的生成[54]。環(huán)氧化物在氧化產(chǎn)物中的含量超過了氫過氧化物且其與DNA、蛋白質(zhì)的反應(yīng)比不飽和醛更加活躍[55]。同時(shí)，由于環(huán)氧化物不一定含有共軛二烯結(jié)構(gòu)也無法采用過氧化物滴定法測定含量，很容易在脂質(zhì)氧化產(chǎn)物檢測的研究中被忽視。目前可以使用GC-MS以及LC-MS等技術(shù)對(duì)環(huán)氧化物進(jìn)行檢測，但這些方法耗時(shí)長且需要衍生化，未來需要開發(fā)更快速有效的方法對(duì)其含量進(jìn)行測定。

3 展 望

由于攝入脂質(zhì)的氧化對(duì)機(jī)體健康的影響不易察覺以及經(jīng)濟(jì)成本上的考量，脂質(zhì)氧化研究大部分都聚焦在食用脂質(zhì)的加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等方面。隨著食用脂質(zhì)的多樣化發(fā)展以及對(duì)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物危害性的認(rèn)識(shí)，學(xué)者們對(duì)于胃腸道中脂質(zhì)氧化的探究將會(huì)不斷加深。體外消化模型在脂質(zhì)體內(nèi)氧化研究領(lǐng)域中的應(yīng)用很廣泛，眾多學(xué)者根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適合的體外消化模型進(jìn)行研究。隨著脂質(zhì)體外消化模型的更新與優(yōu)化，數(shù)據(jù)可靠性、準(zhǔn)確性也在不斷提升。然而，因?yàn)榧夹g(shù)的限制，體外消化模型還無法完全模擬脂質(zhì)在胃腸道中的消化、氧化過程，更加精準(zhǔn)的體外消化模型亟待開發(fā)。同時(shí)，體外模擬消化需要結(jié)合多種脂質(zhì)氧化狀態(tài)評(píng)價(jià)方法，高靈敏度、特異性、高效的胃腸道脂質(zhì)氧化產(chǎn)物檢測方法的更新、優(yōu)化也是目前脂質(zhì)氧化研究的重要內(nèi)容。因此，對(duì)脂質(zhì)在人體消化過程的研究需要結(jié)合體外消化模型、氧化產(chǎn)物檢測方法以及脂質(zhì)代謝、吸收模型等研究手段，進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究，這對(duì)于提升脂質(zhì)質(zhì)量、創(chuàng)制安全健康的功能脂質(zhì)、促進(jìn)脂質(zhì)產(chǎn)業(yè)升級(jí)均有重要意義。