SEC23A 在胃癌中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響

徐園，虞偉明，張苗尊

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國(guó)每年新發(fā)病例及死亡病例分別約占全球的44.1%和49.9%[1]。盡管近年來針對(duì)胃癌的診治措施較前大為改善，但我國(guó)胃癌的5 年生存率僅為35.1%[2]。因而，尋求胃癌新的治療靶點(diǎn)，以抑制腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，提高患者生存率意義重大。SEC23 蛋白是外殼蛋白復(fù)合物II（COPII）的核心成分，包含5 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域（鋅指結(jié)構(gòu)域、軀干結(jié)構(gòu)域、-barrel 結(jié)構(gòu)域、-helix結(jié)構(gòu)域和gelsolin結(jié)構(gòu)域），分為2 個(gè)亞型（SEC23A 和SEC23B）。SEC23A 位于染色體14q21.1，包含22個(gè)外顯子，參與COPII的組成[3]，它介導(dǎo)了大多數(shù)分泌蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸[4]，在影響腫瘤細(xì)胞分泌中起重要作用[5]。研究顯示SEC23A在前列腺癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、黑色素瘤[8]等癌癥進(jìn)展中起抑制作用；然而在膀胱癌中則相反，SEC23A 的高表達(dá)促進(jìn)了膀胱癌的進(jìn)展[9]。但SEC23A 在胃癌中的表達(dá)及作用尚未明確，因此本研究探討SEC23A在胃癌中的表達(dá)及對(duì)患者預(yù)后的影響，為臨床提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020 年11 月至2021 年9 月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院收治的胃癌患者20 例，年齡30 ～86歲；平均54 歲。入選患者均接受了D2根治術(shù)，排除術(shù)前曾接受過放化療等患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)及患者和家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 生信分析采用生信數(shù)據(jù)庫(kù) GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn ）分 析SEC23A在胃癌和非腫瘤樣本的表達(dá)情況；箱線圖和點(diǎn)線圖分析并展示SEC23A在胃癌組織和癌旁非腫瘤組織中mRNA 表達(dá)情況。采用癌癥微陣列數(shù) 據(jù) 庫(kù) Oncomine（http://www.oncomine.org） 分析SEC23A 在胃癌和癌旁非腫瘤組織中的mRNA 表達(dá)情況；設(shè)定差異倍數(shù)1.5 和前10%基因作為閾值，P≤0.05 為有顯著差異。

1.2.2 基因芯片 使用TRIZOL 試劑（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）從20對(duì)新鮮胃癌和癌旁組織中分離出總RNA。使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChips（Affymetrix Inc.）確定基因表達(dá)譜。經(jīng)雜交、清洗、染色和掃描。使用MAS 5.0 算法和Gene Spring Software 11.0（Agilent technologies,Santa Clara,CA,US）讀取和分析數(shù)據(jù)。將上調(diào)和下調(diào)基因的閾值設(shè)置為foldchange≥2 或≤0.5。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 采用Trizol 試劑提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。GAPDH 作為內(nèi)源性對(duì)照。引物序列如下：SEC23A 正義鏈：5’-AGATGGAGTCCGATTTAGTTGGA-3’；SEC23A 反義鏈：5’- CAGGTCTCTCTTTCAGTGGTGT-3’；GAPDH 正 義 鏈：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’；GAPDH 反義鏈：5’- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’；PCR 反應(yīng)條件如下：94℃5min，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，94℃變性15s，56℃退火30s，58℃延長(zhǎng)30s。全部反應(yīng)均重復(fù)3 遍。采用比較閾值循環(huán)（2-CT）方程計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，Ct=Ct（目的基因）-C（tGAPDH），Ct=Ct（樣本）-C（t對(duì)照）；處理后的數(shù)據(jù)以每個(gè)mRNA 的差異倍數(shù)表示。

1.2.4 生存分析 借助Kaplan-Meier plotter、GEPIA及Ualcan等不同數(shù)據(jù)庫(kù)。目的基因：SEC23A；目標(biāo)病種：胃癌。Kaplan-Meier plotter 觀察指標(biāo)：總生存期（OS）、無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）、首次進(jìn)展時(shí)間（FP）；GEPIA 觀察指標(biāo)：OS、PFS；Ualcan 觀察指標(biāo)：OS。通過繪制的生存曲線來分析不同SEC23A表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。P ＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床資料分析 通過下載TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）STAD（胃癌）項(xiàng)目中 level3HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，用單因素和多因素回歸分析評(píng)估SEC23A作為胃癌患者預(yù)后指標(biāo)的獨(dú)立性。納入的變量包括：T 分期、N 分期、M 分期、病理學(xué)分期、年齡、組織分級(jí)、SEC23A表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析和獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。數(shù) 據(jù) 下 載 于 TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）STAD（胃癌）項(xiàng)目中l(wèi)evel3HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)，單因素及多因素Cox 回歸分析采用R（3.6.3 版本）軟件，survival 包用于生存資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。單變量分析中有顯著性的因素采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多變量分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SEC23A在不同生信數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá) GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示SEC23A 在胃癌中呈高表達(dá)，且顯著高于正常組織（P＜0.05）。借助Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)，選取DErrico和Cho兩個(gè)數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步分析了SEC23A 在胃癌中mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果表明SEC23A在胃癌中的表達(dá)含量顯著高于正常組織（P ＜0.05）。

2.2 SEC23A 在胃癌中mRNA 表達(dá)水平 基因芯片結(jié)果顯示SEC23A 在胃癌中的表達(dá)是癌旁組織中的2.91 倍（P ＜0.05），見表1。對(duì)PCR 結(jié)果繪制柱狀圖，顯示SEC23A在胃癌中表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤織[（0.0534±0.0179）vs（0.0176±0.0139），t=7.043，P ＜0.05）。見圖3。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中SEC23A在胃癌中的表達(dá)情況

圖2 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中（DErrico 和Cho 兩個(gè)數(shù)據(jù)集）SEC23A 在胃癌中的表達(dá)情況

圖3 RT-PCR 顯示SEC23A 在胃癌中的mRNA 表達(dá)含量

表1 基因芯片中部分差異基因表達(dá)情況

2.3 生存分析及生存曲線圖 采用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析SEC23A表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SEC23A 高表達(dá)組OS、PFS、FP 均低于SEC23A 低表達(dá)組（均P ＜0.05），見圖4。基于GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析SEC23A表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示SEC23A 高表達(dá)組OS、無(wú)病生存時(shí)間（DFS）顯著低于SEC23A 低表達(dá)組（均P ＜0.05），見圖5。基于Ualcan 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析SEC23A表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，生存曲線顯示SEC23A 低表達(dá)的患者具有更好的生存預(yù)后，見圖6。

圖4 KM-plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中SEC23A 表達(dá)情況與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系

圖5 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中SEC23A 表達(dá)情況與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系

圖6 Ualcan 數(shù)據(jù)庫(kù)中SEC23A 表達(dá)情況與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系

2.4 影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素單因素分析顯示，SEC23A 高表達(dá)、年齡（＞65 歲）、病理分期（III/IV）、T 分期（T3/T4）、N 分期、M 分期及與胃癌患者OS有關(guān)（均P ＜0.05）。多因素分析顯示，SEC23A高表達(dá)是胃癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR：1.535，95% CI：1.078 ～2.184，P=0.017），見表2。

表2 SEC23A 和胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的單因素和多因素回歸分析

3 討論

目前，胃癌的治療手段包括手術(shù)、放化療、靶向治療及新興的免疫治療。手術(shù)仍是至今唯一有希望治愈胃癌的方式。在我國(guó)，早期胃癌的5 年生存率可達(dá)90%以上[10]，但早期診斷率卻較低，僅約10%[11]，大多患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，已是晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，因而我國(guó)胃癌的5年生存率較日、韓等國(guó)低[12]。積極倡導(dǎo)胃癌的早期篩查、提高胃鏡普及率、尋找胃癌有效的治療手段及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，對(duì)提高晚期胃癌患者生存率意義非凡。

COPII是介導(dǎo)大多數(shù)分泌蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體運(yùn)輸?shù)闹匾ぞ遊13-14]，SEC23A 參與COPII 的組裝。因而，SEC23A被視為分泌蛋白功能的調(diào)節(jié)因子[10]。研究顯示，SEC23A可為多種miRNA 的靶點(diǎn)，通過下調(diào)蛋白編碼基因的表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移等[15]，如miR-21 的表達(dá)通過靶向和抑制SEC23A 的表達(dá)，增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]；此外，有報(bào)道顯示SEC23A 是miR-200b 的靶向基因之一，與前列腺癌組織呈負(fù)相關(guān)[17]。但是，在膀胱癌中，SEC23A 則被報(bào)道在膀胱癌中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)是膀胱癌患者預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[9]。

本研究借助GEPIA 和Oncomine 等不同在線的生信系統(tǒng)，分析SEC23A 在胃癌及非腫瘤正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SEC23A 在胃癌中的表達(dá)升高，顯著高于癌旁非腫瘤組織。為了明確SEC23A 在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)差異，筆者采用基因芯片和qRT-PCR 法加以驗(yàn)證。結(jié)果顯示SEC23A 在胃癌中的mRNA 水平明顯高于非腫瘤正常組織。這證實(shí)本研究結(jié)果與生信分析結(jié)果是相一致的，即SEC23A 在胃癌中高表達(dá)。

此外，本研究還借助KM-plotter、Ualcan 等系統(tǒng)分析SEC23A的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果顯示在SEC23A 高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后明顯差于 SEC23A 低表達(dá)的患者，這提示SEC23A 高表達(dá)時(shí)胃癌往往預(yù)后不良。同時(shí)，本研究通過下載TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者（TCGA-STAD）的臨床資料，采用R 語(yǔ)言，作多因素分析顯示，SEC23A是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。以上研究結(jié)果均提示SEC23A可能作為提示胃癌預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。SEC23A 可能參與了胃癌的發(fā)生與發(fā)展，當(dāng)然，本研究尚屬初級(jí)階段，僅憑目前研究結(jié)果不足以說明這些，仍需進(jìn)一步研究（體內(nèi)體外試驗(yàn)等）來證明。但本研究為SEC23A可能成為胃癌潛在治療靶點(diǎn)提供了新的思路和理論依據(jù)，也為更進(jìn)一步研究提供了相應(yīng)的基礎(chǔ)。