替格瑞洛對膿毒血癥小鼠高遷移率蛋白1及免疫功能的影響

袁小晶，王 佳

(1.延安市中醫醫院,陜西 延安 716099；2.西安市中心醫院，陜西 西安 710004)

資料顯示，膿毒血癥在歐洲重癥加強護理病房中的發病率高達30%，其病死率高達35%～55%，在美國與惡性腫瘤、心臟病共同被列為三大常見死因[1]。膿毒血癥是機體內真菌、細菌或病毒感染誘發的全身炎癥反應綜合征，是由某種內毒素結合白細胞或內皮細胞引發的炎癥反應失控，造成內環境紊亂及全身多器官功能障礙，該病不僅病情危急，且具有較高的病死率[2]。因此，如何有效地治療膿毒血癥，預防疾病進一步進展，對臨床具有重要意義。替格瑞洛是新型抗血小板藥物，能夠緩解大腦缺血再灌注損傷；且對小鼠樹突狀細胞免疫功能具有抑制作用，可為冠心病的防治提供理論依據[3]。但目前，臨床關于替格瑞洛對膿毒血癥小鼠高遷移率蛋白1(HMGB-1)及免疫功能影響的研究甚少?；诖耍狙芯繉⑻接懱娓袢鹇鍖δ摱狙Y小鼠HMGB-1及免疫功能的影響，以期為臨床防治膿毒血癥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取100只同月齡健康SPF級BALB/c小鼠，均為雄性，體重(200±20)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(合格證號：1804033)，實驗動物許可證號：SCXK(滬)，2020-0019，飼養于我院動物室，飼養條件為不限水、食物，溫度22～26 ℃，濕度50.00%～60.00%，明暗交替12 h/12 h。替格瑞洛(批號：20180226)；美國Abcam公司生產的辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，igG)二抗；美國Invitrogen公司生產的兔抗鼠HMGB-1抗體；美國Santa Cruz公司生產的兔抗鼠Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax)抗體、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)；武漢碧云天生物科技有限公司生產的白細胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白細胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)；杭州昊鑫生物科技有限公司生產的谷丙轉氨酶(Glutamate pyruvate aminotransferase,GPT)；上?？道噬锟萍加邢薰旧a的谷草轉氨酶(Glutamate oxaloacetate transaminase，GOT);美國Thermo公司生產的Multiskan Sky High酶標儀；美國貝克曼庫爾特有限公司生產的流式細胞儀Cy-tomics FC 500。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備：隨機選取80只小鼠制備膿毒血癥小鼠模型：進食12 h后，將10%水合氯醛注射入小鼠腹腔進行麻醉，麻醉后，切開腹部將回腸與盲端分離，采用環形結扎盲腸根部(回腸盲端1.5～2.0 cm處)，保持腸道順暢，腸壁采用針頭貫穿穿刺，穿刺2次后將腹腔關閉，在小鼠體內頸皮下注射50 mg/kg生理鹽水。

1.2.2 分組及治療：將20只未制備膿毒血癥小鼠模型的小鼠設為空白組，其余制備80只膿毒血癥小鼠模型的小鼠依次設為對照組及替格瑞洛低、中、高劑量組，每組20只。其中空白組和對照組在制備模型后12 h灌胃10 mg/kg蒸餾水；替格瑞洛低、中、高劑量組相同時間點灌胃5、10、15 mg/kg替格瑞洛。

1.3 觀察指標 ①小鼠存活率：統計各組小鼠存活數量，對小鼠存活率進行計算。②小鼠脾指數：所有小鼠均在術后24 h處死，摘除眼球取血，采集血液2 ml，將其置于FP管內，30 min，離心，速度為3000 r/min，10 min后，保留上清液，保存于-40 ℃冰箱內。采集血液后用脫頸法將小鼠處死，將脾臟摘除，將其保存于液氮中。脾指數根據液氮中保存的脾臟進行計算。脾指數=脾重(mg)/體重(g)×1000。③GPT、GOT水平：取上述保存的血清，GPT、GOT水平采用生化分析儀測定。④免疫功能：取上述保存的血清，CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17細胞、調節性T細胞(Reg-ulatory T cell，Treg)水平采用流式細胞儀檢測。⑤Bax、Bcl-2、HMGB-1蛋白表達：將脾組織及血清濃度采用BCA法測定，暗室內曝光顯影后，各條帶采用自動凝膠成像系統分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠存活率比較 空白組、對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組小鼠存活率依次為100%(20/20)、35%(7/20)、55%(11/20)、60%(12/20)、80%(16/20)，空白組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組高于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)。

2.2 各組小鼠脾指數、Bax和Bcl-2蛋白水平比較 空白組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠脾指數、Bax和Bcl-2蛋白水平比較

2.3 各組小鼠GPT、GOT水平比較 空白組GPT、GOT水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組GPT、GOT水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組GPT、GOT水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組GPT、GOT水平優于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠GPT、GOT水平比較(U/L)

2.4 各組小鼠免疫功能比較 空白組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠免疫功能比較(%)

2.5 各組小鼠HMGB-1蛋白水平比較 空白組、對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組小鼠HMGB-1蛋白水平依次為(0.19±0.03)、(0.93±0.06)、(0.61±0.04)、(0.39±0.03)、(0.21±0.02)?？瞻捉MHMGB-1蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組HMGB-1蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組HMGB-1蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組HMGB-1蛋白水平優于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)。

3 討 論

膿毒血癥是一種由病原微生物感染誘發，最終致使機體內多器官功能衰竭的疾病綜合征。膿毒血癥的發病機制極為復雜，至今尚不完全清楚，可能與機體內的多系統、多器官生理病理改變有關，且可能與組織損害、凝血功能障礙、炎癥、感染等相關，已成為臨床棘手問題[4]。目前，臨床并無行之有效的方法治療膿毒血癥，常采用及時診斷及時對癥治療(輔助治療包括正性肌力藥物治療、血管升壓藥物治療及常規治療包括血流動力學支持、液體復蘇、感染源的控制與預防及抗生素治療等)以緩解膿毒血癥患者的臨床癥狀[5]。近年來，關于膿毒血癥的研究較多，但多個新藥在動物實驗上結果證實療效較好，但在臨床并無取得明顯的療效。替格瑞洛是新一代的ADP受體拮抗劑，屬于新型環戊基三唑咪啶類口服抗血小板藥物，不需要活化，可逆地、迅速阻斷血小板二磷酸腺苷誘導的血小板聚集[6]。以往的研究已證實，替格瑞洛對心肌梗死患者具有較好的療效，且能夠有效治療糖尿病合并冠心病患者[7-9]。

本研究采用盲腸結扎穿孔法制備膿毒血癥小鼠模型，術后解剖小鼠腹腔發現腹腔內存在腐臭味，可觀察到膿液，同時盲腸段結扎部位存在發黑壞死，提示盲腸結扎穿孔法制備膿毒血癥小鼠模型成功。動物免疫系統的第一道防線為脾臟，故體現實驗動物的特異性免疫與非特異性免疫的最基本指標為脾臟重量，若小鼠的免疫功能減退則脾臟指數則明顯降低，且低于正常小鼠[10]。本研究結果顯示，空白組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組高于對照組(均P<0.05)，且空白組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組脾指數、Bax、Bcl-2蛋白水平優于對照組(均P<0.05)，提示替格瑞洛可提高膿毒血癥小鼠存活率，恢復脾臟重量，降低機體內損傷，發揮保護免疫損傷的功能，且其作用強度與劑量密切相關。

肝腎功能的重要指標包括GPT、GOT水平[11]，本研究結果顯示，空白組GPT、GOT水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組GPT、GOT水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組GPT、GOT水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組GPT、GOT水平優于對照組(均P<0.05)，提示替格瑞洛可保護膿毒血癥小鼠肝腎功能，從而發揮保護機體內重要臟器的作用，且作用越強則劑量越高。

CD4+屬于一類輔助性T細胞，其活化后能夠刺激大量細胞因子釋放，從而正向調節細胞免疫；而CD8+T細胞又被稱為抑制性T細胞，可負向調節細胞免疫作用[12]。另外CD4+T細胞屬于重要的Th細胞，CD4+T細胞參與免疫反應的整個過程，根據其分泌的不同細胞因子，可分為2個細胞亞群分別為Th1和Th2,其中Th1主要參與分泌腫瘤壞死因子-α、IFN-γ、IL-2，參與細胞免疫，介導心包毒性T細胞反應，促使免疫應答提高[13]；Th2細胞可參與體液免疫，主要分泌IL-2、IL-6、IL-10等，發揮抑制免疫的作用。當機體內Th2細胞因子占主導地位時，可發生抑制免疫，致使病情加重。Th17細胞是一種可特異性分泌IL-17，但與Th1及Th2的CD4+不同；當機體內發生感染時，可通過分泌IL-17、上調特殊細胞因子、促炎性細胞因子與募集中性粒細胞及集落刺激因子，使其遷移到炎癥部位，導致免疫損傷。另外，其分泌的IL-17可介導中性粒細胞動員興奮，發揮介導前炎癥反應的作用[14-15]。Treg細胞具有一群具有抑制免疫作用的細胞群，Treg細胞活化后，可通過轉化生長因子-β和免疫抑制因子IL-10的分泌機制，抑制效應T細胞內細胞轉導系統的激活，致使效應T細胞活化及增殖抑制。而抑制效應T細胞增殖分化則表示機體陷入免疫抑制狀態，致使機體內炎癥因子水平降低[16-17]。本研究結果顯示，空白組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優于對照組(均P<0.05)，提示膿毒血癥小鼠CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平失衡，而替格瑞洛可恢復膿毒血癥小鼠CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平平衡，進而抑制炎癥因子，發揮調節機體免疫的作用，作用與劑量密切相關。

HMGB-1主要由巨噬細胞產生非組核蛋白，屬于細胞外分子，其水平與巨噬細胞狀態密切相關[18-20]。本研究結果顯示，空白組HMGB-1蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組HMGB-1蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組HMGB-1蛋白水平優于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組HMGB-1蛋白水平優于對照組(均P<0.05)，提示替格瑞洛可降低膿毒血癥小鼠HMGB-1蛋白水平，其通過下調HMGB-1蛋白水平恢復其免疫機制。

綜上所述，替格瑞洛可提高膿毒血癥小鼠存活率，提高脾指數，降低GPT、GOT水平，避免肝腎功能受損損傷，調節CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平平衡，調節免疫功能，其可通過下調HMGB-1蛋白水平恢復其免疫機制，其作用與劑量密切相關。