重度低溫誘導大鼠腎臟內質網應激通路活化研究

竇建平，王 寧，劉麗麗，李 軍

內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指細胞的內質網腔內由于未折疊或錯誤折疊蛋白積累而產生的應激反應。因此，也常被稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)。在生理條件下，ERS 傳感器蛋白主要包括蛋白激酶R 樣內質網激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）,肌醇需求酶1α（serine/threonine-protein kinase/endoribonuclease inositol-requiring enzyme 1，IRE-1α）和 活 化 轉 錄 因 子6（Activating Transcription Factor6,ATF6），這些感受器被內質網伴侶免疫球蛋白重鏈結合蛋白（the immunoglobulin heavy chain binding protein，BIP）結合并保持在非活性狀態。一旦發生ERS，這些傳感器蛋白就會從Bip中分離出來，激活下游信號通路，抑制蛋白的翻譯，上調分子伴侶蛋白以增強蛋白折疊能力，并/或通過內質網相關蛋白降解途徑促進未折疊或錯誤折疊蛋白的降解。

目前，關于ERS的研究主要集中在三條主要信號通路，包括PERK-eIF-2α-ATF4通路、IRE-1-XBP1通路和ATF6通路。根據ERS的嚴重程度和持續時間，UPR 可以誘導細胞不同的結局，可以觸發適應性，也會誘導促凋亡反應，以此來最大程度減少細胞進一步損傷[1-3]。

到目前為止，很多研究顯示ERS參與急性腎損傷（acute renal injury,AKI）的發病機制。較長時間中度及重度的低溫，由于心輸出量減少進而引起腎小球濾過率下降，腎血流量下降，最終引起類似急性腎損傷、腎功能不全的表現[4]。目前，大多數研究主要集中在治療性或保護性低體溫上，即利用輕度低溫來對抗損傷因素，比如對抗缺血/缺氧（這些低溫多為局部低溫）。針對重度全身性低溫引起的繼發性腎損傷研究還較少，但是對于軍隊人員，由于各種復雜軍事環境及熱量供應不足，極易產生低溫，影響戰斗力。為了了解全身重度低溫條件下腎臟損傷的機制，為未來戰場低溫救治提供治療依據，我們開展了相關研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 健康清潔級雄性SD 大鼠24只，體質量200～250 g。由軍事醫學研究院動物實驗中心提供。按照處理方法不同隨機分為3 組，每組8 只，分別為對照組（C 組）、輕度低溫組（MH 組）和重度低溫組(SH組)。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫大鼠模型制備方法 大鼠稱重后給予2% 戊巴比妥鈉（Sigma 公司）腹腔內注射麻醉（30 mg/kg）。所有大鼠胸部以下備皮。C 組大鼠僅麻醉后仰臥位固定45 min。利用低溫水槽（貝朗）控制大鼠體溫。根據低溫標準，選擇將中度低溫組（MH 組）大鼠浸泡水溫控制在34 ℃，重度低溫組（SH 組）大鼠浸泡水溫控制在30 ℃。動物研究體溫儀（Bioseb）放置入大鼠食道，每隔5 min 記錄核心體溫。低溫時間持續60 min。實驗結束后12 h，取材，腎臟組織放于液氮中儲存。

1.2.2 Western 印跡實驗 腎臟組織樣本研磨好后加入組織蛋白裂解液（北京普利萊公司）。裂解后4 ℃、離心10 min。吸取上清后進行蛋白質定量測定。蛋白表達采用相對定量，即將所有條帶均與肌動蛋白（β-actin，Fermentas公司）的光密度比值相除得到的相對比值。主要的目的蛋白包括：Anti-PERK、Anti-p-PERK、Anti-IRE-1、Anti-p-IRE-1、Anti-Bip 及Anti-CHOP 抗體（CST），Anti-CIRP 抗體（Abcam），Anti-HSP70抗體（Abcam）。

1.2.3 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟，置于載玻片上，用10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min。用0.1%Triton X-100 在室溫下透化1 h，加一抗，4 ℃孵育24 h，PBS 清洗，加二抗，室溫下再孵育2 h，用DAB染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標 觀察大鼠ERS 通路相關蛋白包括PERK，p-PERK，IRE-1，p-IRE-1，CHOP，Bip 等分子及熱休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）及冷誘導的RNA 結合蛋白（Cold-inducible RNA-binding protein,CIRP）的表達。有研究顯示熱休克蛋白是腎臟缺血再灌注損傷響應程度最高的反應物[5]，CIRP 在諸如體溫過低，缺氧，紫外線輻射等壓力條件下也會上調和分泌[6]。

1.4 統計學處理 應用SPSS 24.0 進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數的差異性比較采用方差分析，經方差分析確定存在差異的多組均數之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物降溫曲線 首先利用低溫水槽對大鼠進行降溫處理，如圖1 所示。MH 組體溫基本在浸泡后5 min 達到目標體溫，隨后上下輕微波動。整個降溫過程持續60 min，其中MH 組大鼠體溫保持在34 ℃。SH 組大鼠體溫保持在30 ℃。三組大鼠體溫差異具有統計學意義。

圖1 三組大鼠的降溫曲線

2.2 低溫大鼠熱休克蛋白70（HSP70）及冷誘導的RNA 結合蛋白（CIRP）活化情況 本研究顯示，HSP70 在兩種低溫條件下，即輕度低溫組（MH 組）和重度低溫組（SH 組）均有較明顯活化，CIRP 蛋白在重度低溫組（MH 組）活化更加顯著，差異具有統計學意義。見圖2。

圖2 大鼠腎臟熱休克蛋白70（HSP70）及冷誘導的RNA結合蛋白（CIRP）表達情況（*表示P＜0.05;**表示P＜0.01；***表示P＜0.001）

2.3 不同低溫條件下大鼠腎臟ERS 通路相關蛋白表達變化 不同低溫會引發內質網通路活化有所差異。MH 組和SH 組的低溫狀態會活化PERK 以及IRE-1，表現為磷酸化PERK（p-PERK）以及磷酸化IRE-1（p-IRE-1）表達上調。其中，p-PERK 隨著低溫程度的加重，磷酸化水平逐漸升高。而IRE-1在輕度低溫條件下就可以出現明顯的磷酸化水平升高。Bip 是一種重要的分子伴侶，也稱為葡萄糖調節蛋白78（glucose regulating protein，GRP78）。是HSP70家族成員，Bip的增加是ERS活化的標志。本研究提示在正常條件下，Bip僅有極少量表達，輕度低溫和重度低溫均會導致Bip 的活化，兩組活化程度相似。CHOP 蛋白是ERS 過程中活化的促凋亡蛋白，在ERS誘導的細胞凋亡中起著至關重要的作用[7]。本研究顯示，僅有重度低溫會誘導CHOP高表達。見圖3。

圖3 不同低溫條件下大鼠腎臟內質網通路活化情況（*表示P＜0.05;**表示P＜0.01；***表示P＜0.001）

2.4 大鼠腎臟CHOP 蛋白免疫組化染色 腎小管是對缺血缺氧比較敏感的部分，對照組可以觀察到，CHOP 蛋白主要表達在腎小管區域。輕度低溫后，腎小管管腔擴張，小管腫脹，細胞間質水腫明顯，細胞排列教對照組紊亂，CHOP 染色變化不明顯。重度低溫組多數小管正常結構破壞甚至消失，小管塌陷，細胞排列紊亂加重，很多小管出現CHOP表達上調，提示凋亡增加。見圖4。

圖4 大鼠腎臟CHOP免疫組化染色（Bar=20μm）

3 討論

低溫能夠減少氧氣消耗，防止線粒體活性的快速喪失。盡管很多研究顯示，輕度低溫可能有助于減少缺血的有害影響，但不是所有的低溫都是有益的。中度及重度的低溫，尤其是全身低溫，會對機體產生損傷性作用。由于低溫會導致全身血管收縮，因此腎臟灌注也會下降，而低溫復溫過程和缺血再灌注損傷過程相似。ERS 參與腎臟缺血再灌注損傷機制，為此，我們開展該項研究，觀察ERS是否也參與低溫損傷這一過程。

腎臟發生損傷后，會激活一系列代償機制減輕細胞損傷，其中一種代償機制就是通過上調HSP減輕腎損傷，恢復細胞穩態。HSP70 是HSP 家族成員，一些研究表明，HSP70在缺血性腎損傷條件下，可以在受損的腎小管中上調[8]。因此，近年來，HSP70 不僅作為腎缺血再灌注損傷的一種靈敏的分子標志物，而且，越來越多研究進行了HSP70 在缺血性腎損傷中的作用和功能研究。有研究顯示，HSP70 在AKI 中具有保護作用，HSP70 參與不可逆受損蛋白質的降解，通過控制調節促凋亡蛋白Bax活性限制腎小管細胞凋亡[9]。本研究發現，低溫會導致HSP70表達增加，這提示兩種低溫均會活化腎臟內HSP70，誘導低溫應激反應，啟動保護性機制。和HSP70 不同，體外和體內實驗表明，CIRP 是一種DAMP。CIRP 的表達上調可以通過多種途徑加重損傷，例如，可誘導腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）和高遷移率組盒1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）的水平，從而導致下游炎癥，反過來，抑制CIRP有助于減輕缺血再灌注損傷[10]。在本研究中發現，重度低溫活化CIRP更加顯著，這提示和輕度低溫相比，重度低溫引發了更為嚴重的損傷。

本研究顯示，輕度低溫和重度低溫均會誘導ERS 產生，表現為磷酸化PERK 以及IRE-1 增加。IRE-1是一種核糖核酸內切酶。當被激活時，IRE-1可以招募其下游分子，并最終激活其下游靶標c-JunN-末端激酶1（c-JunN-terminalkinase,JNK）。在本研究中，兩種低溫均會活化PERK 以及IRE-1 通路。其中輕度以及重度低溫活化IRE-1 程度類似，但是重度低溫對PERK通路活化更加顯著。

進一步，本研究還發現，重度低溫會顯著激活CHOP 表達。在分子水平，ERS 會誘導Bip 在內的一系列ER 分子伴侶活化，啟動蛋白質降解系統。PERK 會通過磷酸化eIF2α 并導致轉錄因子ATF4活化，最終會誘導促凋亡轉錄因子CHOP 蛋白活化。CHOP 也稱為生長停滯和DNA 損傷誘導基因153（GADD153），該蛋白質是C/EBD 轉錄因子家族的成員。該PERK/ATF4/CHOP 軸是ERS 導致凋亡的關鍵通路[11-12]。PERK 活化程度和低溫損傷程度呈現一定相關性，重度低溫p-PERK 活化最顯著，CHOP 蛋白上調也更加明顯。隨后，利用免疫組化，進一步觀察CHOP 在腎臟重度的分布。通過免疫組化染色除了可以觀察到低溫損傷對腎小管形態有所破壞以外，還可以觀察到重度低溫組CHOP蛋白表達明顯增加，主要集中在腎小管部分。這些情況提示重度低溫對腎臟的影響可能和嚴重低溫引發的促凋亡反應有關。

本研究揭示，輕度低溫和重度低溫在活化ERS上有所不同。重度低溫活化PERK 通路活化以及CHOP蛋白表達上調更加顯著。